张文超，崔真毓，王蔚怡，刘 心，刘 欢，黄伟坚
（1.广西大学动物科学技术学院，南宁 530005；
2.广西中医药大学第一附属医院，南宁 530023）
星状病毒（Astrovirus, AstV）是一种单股、正链、无囊膜包被的RNA病毒，可感染包括人在内的多种哺乳动物及禽类。星状病毒属于独立的星状病毒科（Astroviridae），根据其宿主类型可分为哺乳动物星状病毒属（Mamastrovirius）和禽类星状病毒属（Avastrovirus）两个属[1]。星状病毒的基因组为6.2-7.7 kb，包含3个开放性阅读框（open reading frames, ORFs），其中位于基因组5"端的ORF1a和ORF1b负责编码病毒转录和复制相关的非结构蛋白（non-structure protein, nsp）；
而位于基因组3"端的ORF2通过转录形成亚基因组RNA而编码病毒唯一的结构蛋白，即衣壳蛋白（capsid protein，Cap蛋白）[2]。Cap蛋白为80-90 kDa，经细胞内半胱天冬酶和细胞外胰酶的一系列水解切割后，形成具有感染性的成熟病毒粒子[3-4]。星状病毒感染在猪群内十分普遍，其核酸阳性率可达56.4%；
且遗传背景复杂，包含多个亚型[5]。近年来，不断有报道发现以PAstV3为代表的猪星状病毒可造成脑组织感染及相应的神经症状[6-7]，表明PAstV的宿主组织嗜性不限于肠道上皮，其神经致病力及其相应分子基础值得我们深入研究。Cap蛋白作为PAstV唯一的结构蛋白，是决定病毒毒力、细胞嗜性和致病性的主要因素；
Cap蛋白组成病毒粒子核衣壳，决定病毒的吸附、入侵等过程[8-10]，Cap蛋白上包含受体结合区域，也是宿主产生中和抗体的中和目标[11-12]。刘欢等[13]于2013年成功分离到1株猪星状病毒，命名为PAstV-GX1，本研究通过RT-PCR获得PAstV-GX1株的ORF2序列，运用昆虫杆状病毒Bac-to-Bac表达系统成功表达了Cap蛋白。随后结合生物信息学分析方法分析Cap蛋白的序列特征，为PAstV抗体的制备、检测试剂盒的研发及三维结构解析奠定基础。
1.1 病毒、质粒、菌株、细胞及主要试剂PAstVG X 1毒株由实验室分离保存；
昆虫表达载体pFastBac-Dual购自Invitrogen公司；
DH10Bac购自博迈德生物公司；
PK15细胞由实验室保存；
sf9昆虫细胞由磨美兰老师赠送；
E. coliDH5α感受态细胞、RNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒均购自天根生物科技（北京）有限公司；
反转录试剂、LATaqDNA聚合酶、BamHⅠ、HindⅢ限制性内切酶、T4DNA连接酶均购自宝生物工程（大连）有限公司，转染试剂cellfectinⅡ购自Invitrogen公司，胎牛血清、高糖DMEM、sf900Ⅱ细胞培养基购自GIBICO公司；
PAstV GX1株 Cap蛋白单克隆抗体Anti-Cap由本实验室制备保存；
6×His标签单克隆抗体、HRP标记山羊抗鼠IgG购自Proteintech公司。
1.2 引物设计以NCBI公布的PAstV-GX1株序列（GenBank登录号：KF787112）设计扩增ORF2全长引物，为了方便后续检测，在下游引物中引入His标签，引物序列如下：ORF2-F（BamHⅠ）：5"-CGGGATCCATGGCTAGCAAGTCTGGC-3"；
ORF2-His-（HindⅢ）：5"-CCAAGCTTCTAATGGTGATGGT GATGATGCTCGGCGTGGCCTCG-3"。目的大小片段约为2350 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（下划线部分为酶切位点及His标签序列）。
1.3 pFastBac-Dual-ORF2重组质粒的构建与鉴定提取PAstV-GX1感染的PK15细胞内总RNA，反转录合成cDNA后作为模板备用；
使用合成的引物扩增ORF2基因，反应条件为：98℃预变性3 min；
98℃变性10 s；
55℃退火30 s；
72℃延伸2.5 min，共35个循环；
72℃完全延伸10 min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，目的条带经胶回收纯化和BamHⅠ、HindⅢ双酶切后连接至pFastBac-Dual载体。将连接产物转化至DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选后，选取阳性菌落送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序鉴定，将构建成功的阳性克隆命名为pFastBac-Dual-ORF2。
1.4 重组穿梭杆粒Bacmid-Cap的鉴定将pFastBac-Dual-ORF2供体质粒转染至DH10Bac大肠杆菌感受态中，涂布含有卡那霉素（50 μg/mL）、四环素（10 μg/mL）和庆大霉素（7 μg/mL）抗性以及X-gal和IPTG的LB平板进行蓝白斑筛选，37℃培养箱中培养48 h后选取较大白斑进行PCR鉴定，经3次纯化后扩大培养，提取杆粒；
对杆粒使用M13通用引物进行PCR及核酸电泳鉴定，将阳性杆粒命名为Bacmid-ORF2。
1.5 重组杆状病毒的拯救及扩增取对数生长期的sf9细胞均匀铺入6孔板，培养1 h使细胞充分贴壁，将重组杆粒Bacmid-ORF2转染至细胞中，转染方法按CellfectinⅡ试剂盒说明书进行，24～72 h后观察细胞病变（cytopathic effect, CPE）情况，当细胞产生变大、变圆等病变后收集细胞上清液，即为P1代病毒，盲传3代后收集细胞及上清液获进行后续检测。
1.6 Cap-His表达的鉴定向收集到的细胞中加入RIPA裂解液，充分裂解后取上清液加入SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，煮沸5 min后进行Western blot分析鉴定，分别以His标签单克隆抗体和Cap蛋白特异性单克隆抗体对表达情况检测。
1.7 Cap蛋白的生物信息学分析编码PAstV-GX1 Cap蛋白的ORF2基因序列来源于GenBank中公布的PAstV-GX1全基因组序列，登录号为KF787112。将ORF2基因序列翻译为氨基酸序列，利用ExPASy（https://www.expasy.org/）服务器的在线软件ProParam分析Cap蛋白的理化性质[14]，利用CBS（http://www.cbs.dtu.dk/services/）服务器的在线分析工具TMHMM、NetNlyc、Netphos、TagetIP分析有无跨膜区，预测其糖基化位点、磷酸化位点及亚细胞定位；
NLStradamus在线分析核定位序列[15]；
通过IEDB（http://tools.iedb.org/bcell）服务器的BepiPred 2.0在线预测capsid蛋白B细胞表位；
使用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl）在线软件对其二级结构进行预测[14]。
2.1 目的基因的扩增与重组质粒的构建以PAstVGX1 cDNA为模板，扩增ORF2基因，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳分析，可见大小为2350 bp的目的条带（图1），条带位置与预期相符。将产物经双酶切连接至线性化的pFastBac-Dual载体，重组质粒进行质粒PCR鉴定并测序，结果表明成功获得供体质粒pFastBac-Dual-ORF2。
图1 猪星状病毒GX1株ORF2基因的扩增Fig.1 Amplification of the ORF2 gene of strain PAstV-GX1
2.2 杆粒的获得及鉴定将重组质粒转化至DH10Bac大肠杆菌感受态中，经蓝白斑筛选挑取较大白斑培养，利用M13引物进行菌液PCR检测，利用M13引物扩增空载体大小为2560 bp，结果显示在约5000 bp处有目的条带（图2A），与预期大小相符。将阳性单克隆经3轮纯化后提取杆粒，琼脂糖凝胶电泳检测杆粒的大小及纯度，结果显示获得重组杆粒大小比空杆粒略大（图2B），获得较纯杆粒Bacmid-ORF2。
图2 重组穿梭质粒的获得及鉴定Fig.2 Acquisition and identification of recombination bacmid plasmid
2.3 重组杆状病毒的拯救重组杆粒转染至sf9细胞后，24～72 h观察细胞状态，可观察到明显病变，与对照组相比，可见细胞增殖缓慢或不增殖，细胞变大且有脱落（图3）；
产生明显病变后收集细胞上清液，获得P1代病毒。
2.4 Cap蛋白在杆状病毒中的表达检测拯救的病毒盲传3代后，收取细胞裂解后进行SDS-PAGE，电泳结束后将蛋白半干转至PVDF膜上，5%脱脂牛奶封闭3 h后，分别用Anti-His标签抗体和Anti-cap蛋白特异性抗体作为一抗，以HRP标记的山羊抗鼠IgG为二抗检测Cap蛋白在sf9细胞中的表达情况，结果显示在约90 kDa处有特异性蛋白条带（图4），说明成功获得杆状病毒表达的Cap蛋白。
图4 重组Cap蛋白的Western blot分析Fig.4 Western blot analysis of recombination Cap protein
2.5 PAstV-GX1遗传进化分析通过使用Mega 5.02生物学软件，将目前已有的10株猪星状病毒全序列及各物种代表株星状病毒及本实验扩增到的PAstVGX1 ORF2基因进行CLUSTAL W（version 1.8）比对，构建星状病毒各物种ORF2基因的遗传进化树，结果显示PAstV-GX1属于基因型PAstV-1，与上海株、加拿大的PAstV-12-3及最早得到的2株猪星状病毒序列（GenBank登录号：AB037272，Y15938）处于同一族群，相比其他基因型或者同型的猪星状病毒，PAstV-GX1与人星状病毒经典株（HAstV-1～HAstV-8）的亲缘性最近。具体的遗传进化分析结果如图5所示。
图5 PAstV-GX1 ORF2基因遗传进化分析Fig.5 Phylogenetic analysis of PAstV-GX1 based on complete ORF2 gene
2.6 Cap蛋白生物信息学分析利用ProtParam在线分析工具对Cap蛋白的基本理化性质进行分析，PAstV-GX1 Cap蛋白氨基酸数目为780，分子式为C3702H5838N1062O1170S24，相对分子质量（molecular weight, MW）为84712.93，理论等电点（protein isoelectric point, PI）为8.52，在哺乳动物体外半衰期为30 h，酵母体内半衰期为20 h，大肠杆菌体内半衰期为10 h，不稳定系数为36.94，亲水系数（GRAVY）为-0.431。将Cap蛋白氨基酸序列上传至NLStradamus预测到两处核定位信号，分别为18-64，775-780；
利用CBS服务器对Cap蛋白的分析结果显示其无跨膜结构域，亚细胞定位为细胞质和细胞核中，有24个糖基化位点，分别为3、10、17、22、24、26、28、30、40、43、59、163、167、172、304、307、308、310、416、463、658、663、671和731。对Cap蛋白的磷酸化位点预测结果如，其中包括52个丝氨酸磷酸化位点，42个酪氨酸磷酸化位点，7个苏氨酸磷酸化位点（图6）。通过SOPMA服务器对Cap蛋白的二级结构在线分析，结果表明Cap蛋白二级结构中α螺旋的比例为22.08%，β折叠的比例为21.82%，β转角比例为4.49%，无规则卷曲比例为51.60%（图7）；
运用Bepipred 2.0对Cap蛋白潜在的B细胞线性表位进行预测分析，结果显示Cap蛋白平均抗原系数为0.506，预测到22个潜在的B细胞线性表位（图8，图9），其中15-37、42-65是抗原性最高的区域，且处在猪星状病毒衣壳蛋白保守区，可作为ELISA检测试剂盒的靶区域。Cap蛋白的表达生物信息学分析为PAstV检测试剂盒的开发和三维结构解析提供了理论支持和重要材料，为猪星状病毒的病原学研究奠定基础。
图6 Cap蛋白磷酸化位点Fig.6 Phosphorylation site of Cap protein
图7 Cap蛋白二级结构Fig.7 Secondary structure of Cap protein
图8 PAstV1 Cap蛋白核定位序列及潜在的B细胞表位Fig.8 NLS and poteintial B cell epitope of PAstV1 Cap protein
图9 Cap蛋白表面抗原性预测Fig.9 Phosphorylation site of Cap protein
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