罗 莉，张厚双，王亚楠，曹 杰，周勇志，周金林
（中国农业科学院上海兽医研究所 农业农村部动物寄生虫学重点实验室，上海 200241）
蜱（Tick）是一种常见的动物体表寄生虫，它们在世界各地广泛分布，被认为是仅次于蚊子的第二大疾病传播媒介[1]，严重危害着人和动物的健康。现今主要通过使用化学杀虫剂来控制蜱，但易产生环境污染和抗药性等问题。因此，现急需开发使用简便、环境友好的新型抗蜱制剂。
RNA干扰（RNA interference, RNAi）作为一种反向遗传方法，已经广泛应用在蜱基因功能的分析研究中[2]。但是，其目前面临的挑战主要是需找到简单可靠的双链RNA递送方法。本课题组研究表明脂质体转染试剂可成功介导dsRNA进入蜱体内，发挥了良好的干扰作用，提示dsRNA抗蜱制剂的应用潜力[3]，但是存在成本高，以及dsRNA的降解率高的缺点。为降低成本，进一步优化dsRNA递送介质，促进商业化开发，本研究制备了包裹dsRNA的还原刺激响应型壳聚糖纳米粒子，用以开展抗蜱实验研究。
纳米基因载体通常是指由生物相容性材料产生的纳米胶囊或纳米颗粒，其能够通过包裹或吸附核酸分子例如外源DNA而形成纳米载体基因复合物。纳米载体的尺寸通常在10～100 nm。由于其较大的表面积比产生的化学活性，对外源DNA具有很好的吸附、浓缩和保护作用[4-5]。在生理条件下壳聚糖纳米载体带正电荷，能与带负电荷的基因相结合。此外壳聚糖纳米材料具有可降解性、对机体无毒副作用和生物相容性等特性[6-7]，使其有望成为基因递送的优良非病毒载体。随着纳米技术的发展，许多新方法在不断提高壳聚糖纳米载体的传递效率。高效的纳米载体技术，不仅需要有良好的生物屏障穿透能力，还要有良好的靶向释放结果[8]。还原刺激响应型纳米粒子是利用组织及细胞内特殊的还原环境（高浓度谷胱甘肽），设计得到的可在生物体细胞内特异性靶向释放药物的纳米载药体系。根据高分子中的二硫键与氧化还原分子的巯基-二硫键进行交换反应而分解的机理，能制备依赖不同GSH浓度而进行药物释放的纳米载体。
实验室前期研究发现，镰型扇头蜱自噬相关分子ATG5基因的双链RNA干扰（dsRhATG5），严重影响蜱的正常吸血过程，是重要的控制蜱靶分子[9]。因此本研究以壳聚糖为原料，通过微乳法制备得到的二硫键交联壳聚糖纳米粒子（CS-SS-CS）包裹ATG5基因的双链RNA（dsRhATG5），得到包裹双链RNA的具有还原刺激响应性壳聚糖纳米粒子(PEG/(CS-SS-CS)/dsRNA)，以进行杀伤蜱虫的效果研究。
1.1 实验材料实验试剂：1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）购自麦克林生化科技有限公司；
N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）购自阿拉丁试剂有限公司；
壳聚糖、冰醋酸、三聚磷酸钠（TPP）、二甲基亚砜（DMSO）、无水乙醇、氢氧化钠、正己醇、环己烷、曲拉通X-100、三聚磷酸钠（TPP）、无水乙醇购自国药集团化学试剂有限公司。实验器材：Nikon Eclipse TE2000荧光显微镜购自日本NikonCorp公司；
Nicoleti iS5型红外光谱仪购自美国Thermo Electron Corp公司；
Tecnai G220STWIN透射电子显微镜购自荷兰FEI Corp公司；
Zetasizer Nano ZS90纳米粒径电位分析仪购自英国Malvern公司；
K-Alpha X射线光电子能谱仪购自美国赛默飞世尔公司。实验动物：不同发育阶段的镰形扇头蜱采自湖北武昌，由本实验室兔体繁殖单雌蜱繁殖传代保存[10-12]；
新西兰大白兔来源于上海松联实验动物公司。
1.2 镰型扇头蜱ATG5基因的双链RNA（dsRhATG5）的制备根据T7 RiboMAXTMExpress RNAi System试剂盒说明书的操作，体外合成并纯化镰型扇头蜱的ATG5基因的双链RNA（dsRhATG5）和对照Luciferase基因的双链RNA（dsLuciferase）。PCR扩增及回收、dsRNA合成和纯化以及浓度检测的方法参考文献[3]。
1.3 包裹双链RNA的还原刺激响应型壳聚糖纳米粒子(PEG/(CS-SS-CS)/dsRNA)的制备本实验以壳聚糖与二硫代二丙酸为材料，以EDC和NHS为交联剂，制备了二硫键交联壳聚糖。以油包水型微乳为纳米反应器，以二硫键交联壳聚糖作为材料形成了壳聚糖纳米粒子[13]，并进行PEG-(CS-SS-CS)的表征分析，最后通过静电作用的壳聚糖-核酸复合物的制备方法包裹dsRNA制作成为具有抗蜱作用的PEG/(CS-SSCS)/dsRNA纳米粒子[14-15]。
1.4 PEG/(CS-SS-CS)的性质表征
1.4.1 PEG-(CS-SS-CS)的微观形貌 PEG-(CS-SS-CS) 悬浮液滴于透射电镜专用的铜网上，用去离子水稀释重悬，并超声分散。用微量移液器取样，吸取适量纳米粒子悬液，滴加到表面镀有碳膜的铜网上，铜网下垫有一层干燥滤纸，可吸收溢出的样品悬液。待样品在空气中自然干燥后，使用透射电子显微镜和高分辨透射电子显微镜观察其微观形态（Transmission electron microscope, TEM）。从电镜照片中随机选取至少120个纳米粒子分析粒径分布，并计算平均粒径（Zeta），并使用纳米激光粒度仪检测表面电位（NPS）。
1.4.2 PEG-(CS-SS-CS)的电子表征 电子能谱（Energy Dispersive Spectrometer, EDS）分析：使用EDS能谱分析仪，检测PEG-(CS-SS-CS)的元素组成。红外光谱（Ftir）分析：使用Perkin-Elmer型傅里叶红外光谱仪（波数范围为4000-500 cm-1）检测壳聚糖、二硫代二丙酸和CS-SS-CS的红外光谱并进行分析。
1.5 PEG/(CS-SS-CS)/dsRNA纳米粒子包封率测定以空白PEG-(CS-SS-CS)纳米粒子为对照，取PEG/(CS-SS-CS)/dsRNA复合物，用超微量分光光度计检测OD260/280值，用以计算总dsRNA的量（C总）。取上述PEG/(CS-SS-CS)/dsRNA纳米粒子，离心后用超微量分光光度计检测上清液中dsRNA的OD260/280值，用以计算上清液中dsRNA的量（C上清）。每组测3次，计算包封率的平均值G%。制备五组平行实验样品，最后检测5个平行实验样品，计算出包封率的平均值¯G %[16]。通过公式计算包封率：包封率G%=[(¯C总-¯C上清)/¯C总]×100%，式中¯C总为每组样品中双链RNA的总量的平均值；
¯C上清为每组样品中PEG/(CS-SS-CS)/dsRNA离心后上清液中游离的双链RNA的量的平均值。检测5个平行实验样品，计算包封率的平均值¯G%。
*本文为江苏省2018年度社科基金项目“基于语料库的江苏海外形象构建研究”（编号：18YYC001）和江苏省2017年度高校哲学社会科学研究基金项目“1946-2016年美国两党国情咨文的批评认知研究”（编号：2017SJB0540）的阶段性成果。
1.6 PEG/(CS-SS-CS)与dsRNA的结合性和抗RNAse I保护性分析PEG/(CS-SS-CS)与dsRNA的结合性分析：PEG/(CS-SS-CS)/dsRNA、双链RNA、离心后PEG/(CS-SS-CS)/dsRNA沉淀、离心后PEG/(CS-SSCS)/dsRNA上清液，经1%琼脂糖凝胶100 V电泳30 min，使用凝胶成像仪照相分析PEG-(CS-SS-CS)与双链RNA的结合能力。PEG-(CS-SS-CS)抗RNAse I保护性分析：取2 μg dsRNA和10 μg PEG/(CS-SS-CS)/dsRNA复合物，分别加入2.0 μL的RNAse I（3.75 U/μL），室温反应10 min。然后用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，观察dsRNA降解情况。
1.7 PEG/(CS-SS-CS)/dsRNA的还原刺激响应性检测GSH可以与二硫键发生氧化还原反应。本实验将PEG/(CS-SS-CS)/dsRNA分别溶于含2 mmol/L GSH和无GSH的水溶液中，室温摇床150 rpm震荡20 min，通过TEM观察该复合物的微观形貌，并检测粒子粒径变化[17]。
1.8 PEG/(CS-SS-CS)/dsRNA的抗蜱实验时间和浓度的确定将成蜱（50只/每组）浸泡于200 μL的PEG/(CS-SS-CS)/dsATG5溶液中（10 ng/μL），设置浸泡时间分别为6、12、18、24 h。其中，对照组1为将成蜱浸泡于溶解于RNase Free ddH2O的dsRhATG5水溶液，对照组2为将成蜱浸泡于溶解裸的壳聚糖纳米粒子NPs(PEG/(CS-SS-CS))溶液，从而筛选出最佳浸染时间。将成蜱（50只/每组）浸泡于200 μL PEG/(CS-SS-CS)/dsATG5溶液中12 h，设置dsRhATG5浓度分别为1、5和10 ng/μL。其中，对照组1为将成蜱浸泡于溶解于RNase Free ddH2O的200 μL dsRhATG5水溶液（10 ng/μL），对照组2为将成蜱浸泡于溶解裸的壳聚糖纳米粒子NPs(PEG/(CS-SS-CS))溶液，从而筛选出最佳浸染浓度。
1.9 PEG/(CS-SS-CS)/dsRNA的抗蜱试验将成蜱150只随机分成3组（50只/每组），浸泡于（200 μL，10 ng/μL）PEG-(CS-SS-CS)/dsRhATG5的溶液中12 h，之后取出成蜱放置于无RNA酶的新管中，观察记录成蜱浸染后24 h的死亡率。将未死亡的成蜱接种在兔耳上，观察48 h内的吸附率、饱血率、饱血时间和饱血重量等生理学现象。同时，将浸泡于（200 μL，10 ng/μL）PEG/(CS-SS-CS)/dsLuciferase和dsRhATG5裸溶液（10 ng/μL）浸染成蜱12 h分别作为其中两组对照组。
1.10 数据分析数据采用Excel 2016提供的ANOVA（Analysis of varance）法进行单因素方差分析。P＜0.05（*）为具有统计学差异，P＜0.01（**）为具有显著地统计学差异，P＜0.001（***）为具有极显著地统计学差异。
2.1 PEG-(CS-SS-CS)的性质表征
2.1.1 电子能谱和红外光谱 为了明确交联反应产物元素组成，检测了二硫键交联壳聚糖的电子能谱。为了进一步明确反应产物里面含有二硫键，分别对壳聚糖、二硫代二丙酸和PEG-（CS-SS-CS）进行了傅里叶红外光谱（Fourier Transform Infrared, FTIR）检测，结果可知，反产物主要含有C、N、O、Na和S，不含有别的元素，说明合成的纳米粒子不含杂质，含有的S元素说明二硫代二丙酸与CS-SS-CS已成功交联，提示可能会有二硫键的形成（图1A）。PEG-(CS-SS-CS)的红外光谱图中，1635 cm-1处也出现一个吸收峰，为-CO-NH-形成的标志，529 cm-1出现了二硫键的特征峰，说明壳聚糖的游离氨基与二硫代二丙酸的羧基形成了酰胺键，反映了壳聚糖和二硫代二丙酸已成功偶联（图1B）。
图1 电子能谱(A)和红外光谱(B)结果Fig.1 Electron energy spectrum (A) and Infrared spectrum (B)
2.1.2 微观形貌观察、粒径及表面电位检测 CS-SSCS和PEG-(CS-SS-CS)的TEM结果分别如图2a，PEG-(CS-SS-CS)的粒径和表面电位如图2b所示；
PEG-(CSSS-CS)纳米粒子的粒径分布图2c和电位图2d。
图2 CS-SS-CS和PEG-(CS-SS-CS)TEM结果、粒径分布图Fig.2 TEM image of CS-SS-CS TEM photo of PEG-(CS-SS-CS) and Particle size distribution map
图3 PEG-(CS-SS-CS)与dsRNA结合性和抗RNAse I保护性Fig.3 SDS-PAGE of PEG-(CS-SS-CS) binding to dsRNA and Protection against RNAse I
由图2c的PEG-(CS-SS-CS)纳米粒子的粒径分布图可知PEG-(CS-SS-CS)纳米粒子的粒径大小为200.80±12.04 nm，且粒径分布均匀。由图2d的PEG-(CS-SS-CS)纳米粒子的电位图可知，平均电位为37.7±0.9 mV，具有较高的表面正电荷，可以强烈的吸附负电dsRNA，形成PEG-(CS-SS-CS)/dsRNA进行杀伤蜱虫的实验。
2.2 PEG-(CS-SS-CS)与dsRNA结合的相关特性
2.2.1 PEG-(CS-SS-CS)与dsRNA的结合性和抗RNAseⅠ保护性分析 为了进一步检测PEG-(CS-SS-CS)与dsRNA的结合效果，进行凝胶成像仪照相分析。利用琼脂糖凝胶电泳对抗RNAseⅠ保护测定，加入RNAseⅠ能够降解游离的dsRNA，所以通过观察琼脂糖凝胶电泳泳道中是否观察到明亮条带，可以证明该PEG-(CS-SS-CS)纳米粒子对dsRNA有保护作用，结果见图2：
在该图3a中，第2泳道中PEG/(CS-SS-CS)/dsRNA复合物在加样孔位置可见明亮的荧光，而在dsRNA对应的位置只可见微弱的荧光，说明制备的壳聚糖纳米粒子能阻滞dsRNA向阳极移动，通过电性作用相互结合将dsRNA滞留于加样孔中。说明成功制备了PEG/(CS-SS-CS)/dsRNA纳米复合物。
在图3b中，第4泳道RNAse Ⅰ和PEG/(CSSS-CS)/dsRNA纳米复合物中，PEG/(CS-SS-CS)/dsRNA复合物被完全阻滞于加样孔中，而第5泳道中RNAseⅠ和裸dsRNA混合物，裸dsRNA被空气中的核苷酸酶完全降解，说明该壳聚糖纳米粒子（PEG/(CS-SS-CS)）能有效地保护dsRNA，以使其免受核苷酸酶（RNAse I）的降解。
2.2.2 PEG/(CS-SS-CS)/dsRNA包封率测定 随机选取5个样品利用超微量分光光度计检测dsRNA的浓度，通过计算最终得到平均包封率为77.62%±5.77%（表1），说明制备的PEG/(CS-SS-CS)纳米粒子对dsRNA具有很好的包封效果。
表1 PEG/(CS-SS-CS)/dsRNA纳米粒包封率Tabel.1 Encapsulation efficiency of PEG/(CS-SS-CS)/dsRNA nanoparticles
2.2.3 PEG/(CS-SS-CS)/dsRNA的还原刺激响应性 本实验通过在TEM下观察分散于不同浓度GSH水溶液中的PEG-(CS-SS-CS)的微观形貌，来确定PEG-(CS-SS-CS)在GSH的作用下的降解情况，PEG-(CS-SS-CS)在不同浓度GSH水溶液中处理后，其TEM微观形貌见图4：
图4 PEG/(CS-SS-CS)/dsRNA的还原刺激响应性的TEM图Fig.4 TEM image of PEG/(CS-SS-CS)/dsRNA reduction stimulus response
由图4可知，在加入GSH之前（图4a）和加入GSH之后（图4b）样品的TEM照片可以看出，PEG-(CS-SS-CS)经GSH处理后球型结构遭到严重破坏，变成为网状结构。这是因为GSH的作用使得PEG-(CSSS-CS)里面的二硫键裂解，结构变松散使得dsRNA大量释放，从而更加容易发挥基因沉默效果。
2.3 PEG/(CS-SS-CS)/dsRNA浸染成蜱最佳时间的确定用RT-PCR检测浸染后的蜱，分析ATG5基因的沉默效果，结果见图5：
图5 PEG/(CS-SS-CS)/dsRNA浸染成蜱最佳时间的确定Fig.5 Determination of the best time for PEG/(CS-SS-CS)/dsRNA to infect adult ticks
由图5结果可知，就成蜱而言，对照组1和对照组2蜱虫的基因沉默效果差异不明显，说明没有壳聚糖纳米粒子包裹的dsRhATG5裸溶液抗蜱效果较低。相比于两个对照组，实验组中成蜱浸染在20 ng/mL的PEG/(CS-SS-CS)/dsRNA溶液中，时间为6、12、18和24 h相对于对照组即干扰6、12、18和24 h都能干扰成蜱体内的ATG5基因。其中干扰12 h的蜱虫mRNA的表达量，相对于干扰6 h和18 h的蜱虫mRNA的表达量（P＜0.001），差异极显著，具有统计学意义，相对于干扰24 h的蜱虫mRNA的表达量（P＜0.01），差异显著，具有统计学意义，说明干扰12 h时基因沉默效果最好，即干扰12 h为最佳浸染时间。
2.4 PEG/(CS-SS-CS)/dsRNA浸染成蜱最佳浓度的确定根据2.3中筛选出的PEG/(CS-SS-CS)/dsRhATG5抗蜱的最佳时间为12 h，将PEG/(CS-SS-CS)/dsATG5的溶液配置不同浓度（dsATG5浓度分别为1、5和10 ng/μL），浸染成蜱（50只/每组）12 h，RT-PCR检测浸染后的蜱的基因沉默效果，结果见图6。
图6 PEG/(CS-SS-CS)/dsRNA浸染成蜱最佳浓度筛选Fig.6 Screening of the optimal concentration of adult ticks with PEG/(CS-SS-CS)/dsRNA
由图6可知：就成蜱而言，对照组1和对照组2蜱虫的基因沉默效果差异不明显，说明没有壳聚糖纳米粒子包裹的dsRhATG5裸溶液抗蜱效果较低。相比于对照组，实验组中的成蜱分别在1、5和10 ng/mL的PEG/(CS-SS-CS)/dsRNA溶液中浸染12 h后，实验组浓度为10 ng/μL时蜱虫mRNA的表达量下降，说明ATG5基因发生了沉默。且10 ng/μL时mRNA的表达量的下降相对于对照组蜱虫mRNA的表达量（P＜0.001），差异极显著，具有统计学意义，说明浸染在10 ng/μL溶液中的蜱虫的基因能够沉默，即10 ng/μL复合物的溶液为最佳浸染浓度。
2.5 PEG/(CS-SS-CS)/dsRNA的抗蜱试验对于成蜱，用PEG/(CS-SS-CS)/dsRhATG5（10 ng/μL）浸染成蜱12 h作为实验组，PEG/(CS-SS-CS)/dsLuciferase和ATG5 dsRNA裸溶液（10 ng/μL）浸染成蜱12 h分别作为两组对照组。浸染成蜱24 h后记录死亡率。然后将未死亡的蜱接种于兔子耳朵上，观察其生物学特性，结果见表2。
表2 镰形扇头蜱成蜱的抗蜱试验结果Table 2 The results of miticides experiment of adult
由表2可知，干扰成蜱后，PEG/(CS-SS-CS)/dsLuciferase和dsRhATG5裸溶液（10 ng/μL）浸染成蜱12 h两组对照组蜱虫的生理现象没有差异，说明没有壳聚糖纳米粒子包裹的ATG5 dsRNA裸溶液抗蜱效果较低。与两个对照组相比，PEG/(CS-SS-CS)/dsRhATG5干扰的蜱虫不影响48 h上体率和24 h死亡率，但是不能完成吸血过程。这些结果表明，该实验制备PEG/(CS-SS-CS)不仅能成功包裹dsRhATG5，而且还能有效传递dsRhATG5，使其发挥较好的抗蜱效果。
根据相关文献报道，有3种细胞转染试剂（Lipofectamine2000、CellfectinⅡ、DMRIE-C）能将较短的dsRNA片段、siRNA转入到细胞内[18-19]。脂质体转染试剂可成功介导dsRNA进入蜱体内，发挥干扰作用，提示dsRNA抗蜱制剂的重要应用潜力[3]。为降低成本，进一步优化dsRNA递送介质，促进商业化开发，本实验以壳聚糖作为原材料，通过油包水型微乳为纳米反应器合成了还原刺激响应性壳聚糖纳米粒子PEG-(CS-SS-CS)。实验结果表明，该纳米粒子具有与dsRNA的结合性好、包封率高、抗RNAse I保护性和还原刺激响应性。
近年来，刺激响应性纳米粒子作为药物载体在肿瘤相关治疗中被大量研究，其药物释放受特定刺激（例如pH，温度和特定酶）诱导引起物理或化学结构变化，这些纳米粒子不仅具有药物缓释的作用，而且在病理学靶点上维持了有效的药物水平[20]。据报道，在蜱虫体内大量表达活性氧（ROS）以及谷胱甘肽S-转移酶，超氧化物歧化酶，热休克蛋白，甚至杀死或抑制微生物的蛋白酶抑制剂[21]，因此，本研究利用蜱体内大量表达的谷胱甘肽进行还原刺激响应性实验。本课题组王亚楠同学所做的针对dsRhATG5实验研究中，运用显微注射的方式，相比于对照组，实验组的成蜱不能完成吸血过程[22]。而本研究的抗蜱结果表明，干扰成蜱后，与对照组相比，PEG/(CS-SS-CS)/dsRhATG5干扰的蜱虫不影响48 h上体率和24 h死亡率，但是不能完成吸血过程，说明该还原响应型壳聚糖纳米粒子能成功包裹和有效靶向传递dsRhATG5，并且与显微注射的方式相比，在抗蜱方法更简便的基础上，达到了同样的抗蜱效果。
本研究提出的新型抗蜱制剂研发和抗蜱策略，虽然在抗蜱实验费时，操作较繁琐等方面有待改进，但是具有原料来源广泛，制备过程简捷，成本低廉，抗蜱效果明显等优势，为今后新型抗蜱制剂的开发和抗蜱技术的探索提供了新思路，以及进一步在其他害虫的杀灭研究中进行运用及推广奠定了基础。
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