摘要[目的] 研究加热前后草鱼红肉中滋味物质的变化。[方法] 分别使用高效液相色谱仪和氨基酸自动分析仪分析了草鱼红肉中加热前后核苷酸类物质和游离氨基酸含量的变化。[结果] 新鲜草鱼红肉中核苷酸总量为1 088.809 μg/g。新鲜草鱼红肉中ATP含量为358.640 μg/g，加热后为0。加热后ADP、AMP、IMP、HxR和Hx的含量分别增加15.502、4.232、7.689、44.917和74.688 μg/g。新鲜草鱼红肉中游离氨基酸总量为3 129.106 μg/g，加热后游离氨基酸总量减少了852.161 μg/g。其中，含量增加的游离氨基酸有天冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、酪氨酸，含量降低的游离氨基酸有苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸、组氨酸等。[结论] 该研究可为今后草鱼热制品的风味研究奠定理论基础。
关键词草鱼；红肉；ATP及其关联物；游离氨基酸
中图分类号S965.112文献标识码
A文章编号0517-6611（2016）02-090-04
Abstract [Objective] To study the changes of flavor substances in red meat of grass carp before and after heating. [Method] The content changes of nucleotides and free amino acids in red meat of grass carp were analyzed by using highperformance liquid chromatograph and automatic amino acid analyzer. [Result] The total content of nucleotides in red meat of fresh grass carp was 1 088.809 μg/g. ATP content in red meat of fresh grass carp was 358.640 μg/g and it reduced to zero after heating. The contents of ADP， AMP， IMP， HxR and Hx after heating increased 15.502， 4.232， 7.689， 44.917 and 74.688 μg/g， respectively. The total content of free amino acids in red meat of grass carp was 3 129.106 μg/g， and it decreased 852.161 μg/g after heating. Among the free amino acids， the contents of aspartic acid， glutamic acid， valine， methionine， leucine and tyrosine increased， and the contents of threonine， serine， glycine， alanine， lysine， histidine decreased. [Conclusion] The research can lay the theoretical foundation for further study on the flavor of heated products of grass carp.
Key words Grass carp； Red meat； ATP and ATPrelated substances； Free amino acids
草鱼，又名白鲩、厚鱼、草根鱼，一般栖息于平原地区的江河湖泊，喜居于近岸多水草区域和水的中下层，为典型的食草性鱼类。由于草鱼生长迅速、肉质肥嫩，营养丰富，已成为我国主要的养殖鱼类之一，是我国淡水养殖的四大家鱼之一。草鱼鱼肉可分为白肉和红肉2个部分。从营养学角度来看，白肉脂肪含量较低，脂肪中不饱和脂肪酸含量较高，肌纤维细致；红肉脂肪含量较高，脂肪中饱和脂肪酸含量较高，肌纤维粗糙。从营养学角度来看，红肉确实不如白肉，但这并不意味着要完全将红肉拒之门外。与草鱼白肉相比，草鱼红肉中含有较丰富的锌、铁等微量元素以及蛋白质、核黄素、维生素B12等，这些成分对人体健康至关重要，尤其是正处于生长发育期的儿童。目前，对于草鱼白肉部分的研究较多，且主要是针对鱼肉的挥发性气味成分的研究。施文正等[1]对草鱼背肉和腹肉中的挥发性成分进行了分析。江健等[2]分析了草鱼熟鱼肉中的挥发性成分的组成。然而，对草鱼鱼肉中滋味成分的研究报道则偏少，对草鱼红肉的研究更为少见。
为研究草鱼红肉中的滋味成分以及加热对于滋味成分的影响，笔者使用高效液相色谱仪和氨基酸自动分析仪等分析了草鱼红肉中加热前后核苷酸类物质和游离氨基酸等水溶性成分的变化，旨在为今后草鱼热制品的风味研究提供理论基础。
1材料与方法
1.1试验原料及其预处理
草鱼，购自江苏省相城区水产品批发市场，体质量为2.0～2.5 kg/条，充氧后运回实验室，暂养一段时间后宰杀。新鲜草鱼宰杀后，沿脊背剖成2片，将上部分的白肉去除后，取接近皮组织部位的红肉，将一部分红肉置于蒸锅内，常压下加热15 min，自然冷却后与新鲜红肉一起备用。
1.2主要试剂与仪器
1.2.1试剂。三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、肌苷酸（IMP）、次黄嘌呤（Hx）标准品，均购自Sigma公司；一磷酸腺苷（AMP）标准品，由日本TCI公司生产；次黄嘌呤核苷（HxR）标准品，由德国Dr.Ehrenstorfer公司生产；高氯酸（AR）、氢氧化钾（AR）、三氯乙酸（AR）、氢氧化钠（AR）、磷酸（AR）、甲醇（GR），均由国药集团化学试剂有限公司生产；磷酸氢二钾（GR）和磷酸二氢钾（GR），均由上海安谱科学仪器公司生产。
1.2.2仪器。CFXB305M电饭锅，为江门市威多福电器有限公司产品；AUW320电子分析天平和LC2010CHT高效液相色谱仪，为日本岛津公司产品；FA25均质机，为Fluko公司产品；H2050R高速冷冻离心机，为长沙湘仪有限公司产品；雷磁PHS3C酸度计，为上海精密科学仪器有限公司产品；L8800日立氨基酸自动分析仪，为HITACHI公司产品。
1.3试验方法
1.3.16种核苷酸类物质的测定。6种核苷酸类物质的测定参考Yokoyama等[3]的方法，并稍做改动。分别取新鲜红肉及加热后红肉各5 g放置于50 mL离心管中，加入10 mL 10%的高氯酸，匀浆后以10 000 r/min的转速离心15 min，取上清液。将沉淀用5 mL 5%的高氯酸洗涤，再以相同的转速离心取上清液，重复操作2次，合并上清液，用10 mol/L和1 mol/L的氢氧化钾溶液调节pH为6.5，静止30 min后取上清液定容至50 mL，摇匀后0.45 μm膜过滤待测。整个操作在0～4 ℃环境中进行。
高效液相色谱（HPLC）条件：GL Sciences公司Inertsil ODSSP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱；流动相A： 0.05 mol/L磷酸二氢钾和磷酸氢二钾（1∶1）溶液，用磷酸调pH为6.5；流动相B： 甲醇溶液；等梯度洗脱；流速：1 mL/min；柱温：28 ℃；进样量：10 μL；检验波长：254 nm。
1.3.2游离氨基酸含量的测定。
参考张丹丹等[4]的方法，并稍做改动。分别取新鲜红肉及加热红肉各2 g置于20 mL离心管中，加入15 mL 15%的三氯乙酸，匀浆后10 000 r/min离心15 min；取5 mL上清液用氢氧化钠调节pH为2.0，然后定容至10 mL，摇匀后0.22 μm膜过滤待测。
氨基酸自动分析条件：色谱柱（4.6 mm×150 mm，7 μm）；柱温50 ℃；1通道流速为0.4 mL/min，2通道流速为0.35 mL/min。流动相：pH为3.2、3.3、4.0、4.9的柠檬酸钠和柠檬酸的混合缓冲液以及浓度为4%的茚三酮缓冲液。
1.4数据处理试验数据均使用Excel和SPSS统计软件进行统计与分析，结果均以平均值±标准差表示。
2结果与分析
2.16种核苷酸标准品的高效液相色谱图
从图1可以看出，6种核苷酸物质在15 min内得到了有效分离，从左到右依次为肌苷酸（IMP）、三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、一磷酸腺苷（AMP）、次黄嘌呤（Hx）、次黄嘌呤核苷（HxR）。
2.2草鱼红肉中核苷酸类物质的含量分析
可以看出，新鲜草鱼红肉中三磷酸腺苷ATP的含量为
358.640 μg/g，加热后红肉中ATP含量消失为零，这主要是因为ATP在活鱼体内占优势，它为鱼体的活动代谢提供能量，活鱼宰杀后ATP就会降解产生一系列的相关关联物。随着ATP的降解，ADP、AMP、IMP、HxR、Hx这几种核苷酸在草鱼红肉中的含量分别由原来的124.593、56.397、459.249、40.682、49.248 μg/g增加到140.095、60.629、466.938、85.599、123.936 μg/g，增加量分别为12.442%、7.504%、1.674%、110.410%、151.657%。ATP、ADP、Hx和HxR含量变化显著，而AMP和IMP含量无显著变化。在这5种核苷酸中，ADP、AMP、IMP增加量小于Hx和HxR的增加量，这主要是因为ATP降解产生ADP、AMP、IMP、Hx和HxR后，ADP、AMP和IMP自身也会发生降解产生Hx和HxR。
2.3游离氨基酸标准品的高效液相色谱图
共检查17种游离氨基酸，图3中含有16种游离氨基酸标准品的色谱图，从左到右依次为天冬氨酸（Asp）、苏氨酸（Thr）、丝氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、半胱氨酸（Cys）、缬氨酸（Val）、甲硫氨酸（Met）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、赖氨酸（Lys）、组氨酸（His）、精氨酸（Arg），而脯氨酸（Pro）由另一通道体现。
2.4草鱼红肉中游离氨基酸含量分析
由表2可知，在新鲜草鱼红肉中含量较高的游离氨基酸主要有谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸等，含量分别为103.080、440.991、279.528、131.251、1 300.120和210.077 μg/g，其相对百分含量分别为3.294%、14.093%、8.933%、4.195%、41.549%和6.714%；加热后草鱼红肉中含量较高的游离氨基酸主要有谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、脯氨酸等，含量分别为172.815、131.210、213.825、115.160、845.106和130.368 μg/g，其相对百分含量分别为7.590%、5.763%、9.391%、5.078%、37.116%和5.726%。加热后鱼肉中含量增加的游离氨基酸有天冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、酪氨酸，增加量分别为55.829%、67.651%、5.151%、6.127%、16.791%和13.164%；加热后含量降低的游离氨基酸有苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸、组氨酸等，减少量分别为21.675%、8.475%、70.247%、23.505%、34.998%和37.943%。在游离氨基酸总量方面，新鲜草鱼红肉中的含量为3 129.106 μg/g，加热后游离氨基酸总量为2 275.945 μg/g，加热前后游离氨基酸总量减少了27.265%。出现这种情况的的主要原因有可能是因为游离氨基酸属于水溶性物质，加热时会随着水分的蒸发而流失，同时在加热状态下鱼肉中的一部分蛋白质会发生降解产生一定量的氨基酸，正是由于这2种因素共同作用才造成了游离氨基酸以及游离氨基酸总量的波动变化。
3讨论与结论
ATP及其分解产物是水产动物肌肉中核苷酸的重要组成部分，国内外对ATP在鱼死后的降解途径研究较多，一般认为是鱼死后ATP在其体内的的降解途径为三磷酸腺苷（ATP）、二磷酸腺苷（ADP）、一磷酸腺苷（AMP）、肌苷酸（IMP）、次黄嘌呤核苷（HxR）、次黄嘌呤（Hx）[7]。同时，Saito等[8]在20世纪60年代还提出了以ATP及其分解产物作为鱼贝类鲜度的指标。
同时，ATP的分解产物也与鱼肉的风味有关。大多数人认为IMP是肉类物质的主要呈味物质，是一种鲜味极强的增鲜剂[9]，对鱼肉的新鲜风味、适口感、美味等有重要贡献。当与谷氨酸共存时IMP的呈味阈值下降，因此二者有明显的鲜味增效作用[3]。Yokoyama等[3]认为AMP与糖原共同作用也可产生鲜味。高含量的Hx与腐败鱼肉的苦味有关，ATP及其前几种分解产物向Hx的降解造成了Hx的堆积，同时导致了鱼肉愉快风味的失去。
游离氨基酸在鱼体内属于含氮化合物一类，它们是鱼肉滋味物质最主要的组成部分之一，对鱼肉风味产生重要的影响[10]。与贝类相比，鱼中游离氨基酸的含量较低，但是当某些游离氨基酸以足够高的浓度存在于鱼肉中时，它能够独立于其他成分而对鱼的风味产生一定的作用[11]。据报道，甘氨酸对鱼的甜味有一定的贡献[12]，组氨酸造成了某些海产品中的“肉香”特征[13]，谷氨酸的钠盐具有鲜味。同时，鱼肉中谷氨酸的钠盐还可与鱼死后肌肉中所堆积的一磷酸腺苷产生协同作用，可以提高鲜味[14]。精氨酸可以增加鱼肉呈味的复杂性程度并提高鲜度，甲硫氨酸则是海胆风味中不可缺少的呈味物质[14]。
笔者以草鱼红肉作为研究对象，研究了其滋味物质核苷酸和游离氨基酸的含量，同时对其进行加热处理，并与新鲜红肉进行对比，分析热处理对草鱼红肉核苷酸和游离氨基酸含量的影响。结果表明，新鲜草鱼红肉中6种核苷酸的含量分别为358.640、124.593、56.397、459.249、40.682和49.248 μg/g，核苷酸总量为1 088.809 μg/g，这一结果与惠心怡[15]在淡水鱼肉水溶性成分的分析中测得的草鱼背肉中4种核苷酸（ATP、ADP、AMP、IMP）总量（5 660 μg/g）相比，其结果明显小于惠心怡[15]的测定结果。加热后红肉中ATP消失不见。其他核苷酸含量均呈现不同程度的增加，这主要是因为ATP主要是为活鱼的活动提供能量，鱼死后ATP降解产生一系列的相关产物。
该试验中新鲜草鱼红肉中含量较高的氨基酸有谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸等；加热后红肉中含量较高的氨基酸有谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、脯氨酸等。在草鱼红肉中加热前后含量增加的氨基酸有天冬氨酸、谷氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、酪氨酸，增加量分别为55.829%、67.651%、5.151%、6.127%、16.791%和13.164%；含量降低的有苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸、组氨酸等，减少量分别为21.675%、8.475%、70.247%、23.505%、34.998%，37.943%。该试验测得新鲜草鱼红肉中游离氨基酸总量为3 129.106 μg/g，小于惠心怡[15]测得的游离氨基酸总量（3 889 μg/g）。
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