俞露，刘玉林，朱秋媚，张宇，李继宏，刘莹，刘景会
长春生物制品研究所有限责任公司重组蛋白药物研究室，吉林 长春 130000
人生长激素（human growth hormone，hGH）在临床上广泛用于治疗GH 缺乏症（growth hormone deficiency，GHD）、特纳综合征、严重烧伤及慢性肾脏病等［1-8］。生物学活性作为生物制品最关键的质量属性是产品必检项目［8-9］，而对于hGH，目前《中国药典》及《美国药典》中的检测方法均为幼龄大鼠去垂体法。由于去垂体可能导致大鼠死亡，也可能出现去除不净而导致实验数据不准确的情况，制备模型需要较高的实验水平，且从建模至实验结束需至少25 d，目前大部分研发公司无法达到此项动物实验所需要的清洁条件［9-11］。
本实验旨在建立报告基因法（reporter gene assay，RGA）检测hGH 的生物学活性：以HEK293／GH-Luc细胞作为效应细胞，通过hGH 与细胞膜上的hGH 受体（hGH receptor，hGHR）结合，从而激活荧光素酶（luciferase，Luc）的表达，Luc的表达水平与hGH 的生物学活性成正相关，加入细胞裂解液和Luc 底物后，测定其发光强度，以此确定hGH 的生物学活性。该方法快速、灵敏且操作简便，有望替代传统体内生物学活性检测方法，用于hGH 的活性评价及质量控制。
1.1 细胞及样品 HEK293／GH-Luc 细胞购自中国食品药品检定研究院；
hGH 原液（批号：S20200303）及成品（批号：S20190501）由本公司重组蛋白药物研究室制备。
1.2 主要试剂及仪器 hGH 国家标准品（3.0 IU／1.0 mg，批号：140635-201805）购自中国食品药品检定研究院；
MEM 培养基购自美国Hyclone 公司；
胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自浙江天杭生物科技有限公司；
荧光素酶检测试剂盒购自美国Promega公司；
96 孔透明培养板和底部透明白板购自美国Corning公司。
1.3 细胞培养 HEK293／GH-Luc 细胞复苏后，每2 ～3 d 按1∶4 传代1 次，培养基为含10% FBS 的MEM，细胞培养稳定后取对数生长期的细胞用于活性检测。
1.4 方法的建立 将标准品及样品预稀释至1 μg／mL，在透明细胞板中3倍系列稀释后，每孔取70 μL 移入白板中，共8个稀释度，每个稀释度设2个复孔；
将处于对数生长期的HEK293／GH-Luc 细胞消化后，用培养基重悬，调整细胞密度为（3.5 ～3.8）×105个／mL，加入白板中，70 μL／孔，并设阴性对照（用培养基替代），将细胞培养板置于37 ℃，5% CO2条件下培养18 ～24 h；
弃去培养液，加入细胞裂解液，100 μL／孔，作用10 min；
加入底物溶液（Bright-Glo Luciferase Assay Substrate），80 μL／孔，避光作用2 min，用化学发光酶标仪读取相对光单位（relative light unit，RLU）值。
1.5 数据处理 利用分析软件Gen5 Secure 3.08 进行四-参数Logistic回归，拟合剂量反应曲线，计算样品的相对效价。
式中Pr 为标准品生物学活性；
Ds 为供试品预稀释倍数；
Dr 为标准品稀释倍数；
Es 为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数；
Er 为标准品半效量的稀释倍数。
1.6 方法的验证
1.6.1 专属性 分别使用hGH 原液、原液缓冲体系、注射剂缓冲体系、FBS、阴性对照作为供试品进行活性检测，验证产品的辅料成分及培养基中的血清成分对检测结果的干扰。
1.6.2 重复性 对1 批样品重复检测6 次，计算相对效价的几何变异系数（geometric coefficient of variation，GCV）。
1.6.3 中间精密度 由2 名实验员在不同时间分别对不同批次原液进行活性测定，各检测3 次。分别计算4批原液6次相对效价测定值的GCV。
1.6.4 相对准确度及线性范围 取hGH标准品，稀释至1 μg／mL的60%（0.6 μg／mL）、80%（0.8 μg／mL）、100%（1.0 μg／mL）、160%（1.6 μg／mL）作为供试品，每个浓度分别重复测定6 次，计算相对偏差。以效价理论值的对数为横坐标，相应效价测定值的对数为纵坐标做图，采用最小二乘法进行线性回归，计算回归方程的斜率及决定系数，并评估符合相对准确度、线性要求时的效价水平范围，该范围应至少涵盖相对效价的质量标准范围（80%～150%）。
1.6.5 耐用性 取3批原液、1批成品作为供试品，将第10、28代HEK293／GH-Luc细胞分别按3.5×105、3.8 × 105个／mL 的密度铺板，并在4 次检测中将4批样品分别依次置于细胞板的不同位置，见表1；
另取1 批原液，在加入荧光酶底物后显色时间分别设为2、8、16 min，以验证方法的耐用性。计算不同实验条件下相对效价测定值的GCV。
表1 耐用性验证方案1Tab.1 Scheme 1 for durability verification
1.7 方法的应用 应用建立的方法对市售不同厂家（1、2）的GH产品及1批国家标准品进行活性检测。
2.1 方法的验证
2.1.1 专属性 原液及注射剂缓冲液、FBS无效应曲线，吸收值与阴性对照相似，表明产品中辅料成分及培养基中血清成分不会对活性检测结果产生影响。见图1。
图1 专属性验证结果Fig.1 Verification for specificity
2.1.2 重复性 1 批样品重复检测6 次相对效价的GCV为6.794%，远小于《生物制品生物活性／效价测定方法验证指导原则》要求（低于20%）。见表2。
表2 重复性验证结果Tab.2 Verification for repeatability
2.1.3 中间精密度 2 名实验员不同时间对不同批次样品检测的相对效价GCV均低于20%，见表3。
表3 中间精密度验证结果Tab.3 Verification for intermediate precision
2.1.4 相对准确度及线性范围 不同浓度供试品相对效价测定值的相对偏差均在±12%范围内。回归方程的斜率为0.982，在0.80 ～1.25 范围内；
决定系数（R2）为0.997，大于0.9；
该方法中符合相对准确度、线性要求时的效价水平范围为60% ～160%，涵盖了其成品质量标准（80% ～150%）范围。见图2和表4。
图2 线性范围验证回归曲线Fig.2 Regression curve of linear range verification
表4 线性范围验证结果Tab.4 Verification for linear range
2.1.5 耐用性 3 批原液及1 批成品在不同细胞代次、细胞密度及加样位置的条件下，相对效价测定值的GCV分别为4.758%、4.430%、7.294%和2.771%，均小于20%，见表5；
同1 批原液加入荧光素酶底物反应不同时间结果的GCV为0.998%，虽然酶标板各孔的吸收值随着时间变化有所降低，但活性检测结果无明显变化，表明在实验过程中可发生的条件变化不会对检测结果产生影响。
表5 耐用性验证结果（IU／mg）Tab.5 Verification for durability（IU／mg）
2.2 方法的应用 使用建立的方法对市售不同厂家的GH进行生物学活性检测，厂家1检测结果为5.02 IU／瓶，厂家2 为4.85 IU／瓶，国家标准品为3.1 IU／支（均与标示量一致），本公司原液比活性为3.3 IU／mg，满足《中国药典》三部（2020 版）关于GH 比活性应不低于2.5 IU／mg的质量标准，表明该方法可用于GH的生物学活性评价。见图3和表6。
图3 市售产品检测曲线Fig.3 Detection curve of commercial products
表6 RGA检测市售、标准品及在研GH结果Tab.6 RGA results of commercially available，standard products and GH under development
RGA 是通过分子生物学手段，将报告基因整合入待测生物系统中，继而通过检测报告基因产生的信号，研究特定的生物学过程的方法［12-16］。RGA 目前逐渐应用于生物制品的生物学活性检测，一般是建立细胞模型后，通过待测药物激活特定信号通路启动效应物质表达，从而反映药物的生物学活性［17-21］。目前该方法已广泛应用于IFN、促胰岛素分泌肽融合蛋白［22］、促红细胞生成素［23］等生物制品的活性检测。生物制品的微小工艺变化均可能影响蛋白的修饰、结构、杂质的产生等，从而影响产品的活性，而传统的活性检测方法如细胞增殖法、细胞病变法等一般灵敏度较低，无法显示出微弱的差异，且目前GH 生物学活性检测方法为大鼠去垂体法，该方法存在一定的难度，《中国药典》对于GH生物学活性只需每年检测1 次，但对于研发人员，产品的生物学活性代表最重要的质量参数，因此，建立快速、灵敏的检测方法至关重要，可指导工艺开发优化、产品稳定性研究等，提高研发效率。
在方法建立过程中，由于血清成分中可能含GH类似物，对FBS 是否会干扰GH 活性检测进行了验证，结果显示，33%以下浓度的血清对检测结果无影响，与阴性一致。本实验通过对起始浓度、细胞密度、稀释梯度等各项试验参数进行了筛选及优化，成功建立了RGA 检测hGH 生物学活性，并对方法进行了验证。专属性验证主要考察了各种辅料成分对检测结果的影响，检测范围指能满足准确度、线性且涵盖产品质量标准的准确范围，耐用性验证重点考察了细胞密度、细胞代次、加样位置、加入底物反应时间对检测结果的影响，因为这几个试验因素在日常检测过程中是不能准确控制的因素，验证结果显示，均符合要求。本研究建立的方法有望替代大鼠去垂体法，作为hGH生物学活性的评价方法。
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