徐赛赛， 曹亚兵， 曹喜兵， 董洋， 翟晓巧， 范国强
(1.河南农业大学林学院，河南 郑州 450002；
2.河南省林业科学研究院，河南 郑州 450008)
9-顺式-环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase, NCED)，能够催化新黄质和紫黄质氧化形成黄质醛，是脱落酸(abscisic acid, ABA)生物合成过程中的关键限速酶[1]。该蛋白包含一个RPE65结构域[2]。第一个NCED基因由TAN等[3]从玉米vp14突变体中鉴定得到。随后，其同源基因在拟南芥(Arabidopsisthaliana)、烟草(Nicotianatabacum)、水稻(Oryzasativa)和棉花(Gossypiumhirsutum)等物种中被鉴定出来[4]。
近年来，研究者们发现，NCED基因在植物响应非生物和生物胁迫过程中具有重要作用。尹欣幸等[5]发现，低温和干旱胁迫能诱导椰子NCED2表达，而盐胁迫处理抑制其的表达；
干旱胁迫能使西葫芦CpNCED2表达量升高[6]；
LI等[7]发现，白蜡FvNCED3在盐和ABA胁迫下的表达量增加，而在高温和低温胁迫下降低；
在患有溃疡病的柑橘中，发现NCED在感病植株中的表达水平升高[8]；
在茄链格孢感染的马铃薯中，发现NCED基因显著下调[9]；
同样，在黄瓜绿斑驳花叶病毒侵染后，甜瓜中大部分NCED基因的表达量下调[10]。此外，科研工作者发现NCED的表达升高能够导致拟南芥[11]、水稻[12]和高粱[13]腋芽休眠，减少植株的分枝形成，但是，截至目前，有关NCED在泡桐丛枝病腋芽分化中的作用还未见报道。
白花泡桐原产于中国，是最重要的速生落叶乔木之一[14]。因具有重要的生态价值和经济价值，现已报道在世界多个国家被引种[15-16]。然而，该树易被植原体感染而发生丛枝病，造成腋芽丛生，叶片变黄，节间变短，生长速度减慢，成材质量降低，严重影响泡桐产业的发展[17-19]。前期，在泡桐-植原体相互作用方面，已有关于转录组[20]、ceRNA[21]和蛋白组[22]等方面的研究报道，并且发现PfNCED在植原体侵染后表达量显著变化。因此，为进一步揭示PfNCED家族成员在丛枝病发生中的作用，本研究利用白花泡桐全基因组鉴定PfNCED家族，分析其基因结构、系统进化、启动子作用元件以及响应植原体侵染的表达模式，并预测其蛋白互作网络。基于以上分析，筛选出白花泡桐中响应丛枝植原体侵染的PfNCED。为阐明PfNCED在泡桐植原体侵染研究中的重要作用提供理论依据。
1.1 试验材料
本研究所用材料为河南农业大学林木生物技术实验室培养30 d的白花泡桐健康(healthyPaulowniafortunei, PF)和丛枝植原体感染的组培苗(P.fortuneiinfected with phytoplasmas, PFI)，材料的培养参考FAN等[23]的方法。
1.2 试验方法
1.2.1 白花泡桐NCED基因的鉴定与理化性质分析 白花泡桐全基因组数据下载自NCBI数据库[19]。RPE65结构域的隐马尔可夫模型下载自Pfam数据库(https://pfam.xfam.org/)。拟南芥NCED基因家族的蛋白序列下载自TAIR数据库(https:// www. arabidopsis.org)。本研究首先以RPE65结构域模型为种子文件，采用HMMER 3.0程序[24]在白花泡桐所有蛋白序列中进行搜索，阈值设置为e<1e-5；
然后以拟南芥NCED(A.thalianaNCED, AtNCED)蛋白序列作为种子序列，采用BLASTP程序在白花泡桐所有蛋白序列中以e<1e-5的阈值进行搜索。最后，将上述两种方法获得的结果进行分析，以确定PfNCED家族成员。本研究采用Pfam数据库和CDD数据库，对鉴定到的NCED家族成员进行结构域验证，并根据PfNCED在染色体上的位置对其进行命名。本研究将PfNCED的蛋白序列提交至ExPASy网站(https://web.expasy.org/compute_pi/)[25]，预测PfNCED蛋白的理化性质，并使用WoLFPSORT在线网站 (http://www.genscript.com/psort/ wolf_psort.htm l)进行亚细胞定位预测。
1.2.2 白花泡桐NCED基因的进化树、保守基序、和基因结构分析 本研究使用ClustalW对PfNCED的蛋白序列进行序列比对，然后使用MEGA 7.0软件采用邻接法构建进化树[26]；
使用在线软件MEME(http://memesuite.org/tools/meme)进行保守基序鉴定[22]；
根据白花泡桐基因组注释文件对PfNCED的基因结构进行分析。上述结果采用TBtools软件进行可视化[27]。
1.2.3 白花泡桐NCED基因的染色体定位和共线性分析 本研究基于白花泡桐基因组信息采用TBtools软件进行染色体定位分析，探索PfNCED基因家族成员间具有共线关系的基因对，鉴定共线基因对间的复制类型并计算其非同义替换率(Ka)和同义替换率(Ks)。
1.2.4 白花泡桐NCED基因与其他物种间的进化树和共线性分析 拟南芥基因组数据下载自TAIR数据库，水稻NCED(OryzasativaNCED, OsNCED)氨基酸序列和基因组数据下载自NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。采用MEGA 7.0[21]构建进化树；
采用TBtools[28]进行共线性分析。
1.2.5 白花泡桐NCED基因的启动子顺式作用元件分析 本研究采用TBtools[23]提取PfNCED启动子上游2 kb碱基序列作为启动子区域，并采用Plant CARE (http://bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)进行启动子区域的顺式作用元件预测[29]。
1.2.6 白花泡桐NCED基因响应植原体侵染的表达模式分析 PF、PFI、利福平处理的PFI植物中PfNCED的RNA测序(RNA-seq)数据从NCBI SRA数据库中下载(SRA登录号SRR11787883, SRR11787894, SRR11787905, SRR11787912～SRR11787921, SRR11787925～SRR11787931, 和SRR11787935～SRR11787941)[19]。利用TBtools软件[23]绘制PfNCED基因表达热图。基因表达的结果采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)进行验证。总RNA提取和qRT-PCR参照LIVAK等[30]的方法，以核糖体18SRNA为内参基因，试验进行3个生物学重复，相关引物序列见表1。
表1 qRT-PCR引物序列Table 1 The primers used for qRT-PCR
1.2.7 白花泡桐NCED蛋白互作网络预测分析 基于白花泡桐与拟南芥间的同源性，本研究利用STRING 数据库(https://string-db.org/cgi/input.pl)[31]预测并构建PfNCED蛋白间的相互作用网络。使用Cytoscape软件(https://cytoscape.org/download.html)[32]对预测结果进行可视化。
2.1 白花泡桐NCED基因的鉴定与理化性质分析
本研究共鉴定到28个PfNCED家族成员，根据它们在白花泡桐染色体上的位置信息依次命名为PfNCED1～PfNCED28(表2)。理化性质分析结果显示，28个蛋白质的氨基酸数量在198～613个之间；
相对分子质量为22.1～67.9 kD；
等电点为5.51～8.92，其中，10个PfNCED为碱性蛋白(pI >7)，18个PfNCED为酸性蛋白(pI<7);不稳定系数为29.13～44.72。这一结果说明该家族成员中既有稳定蛋白又有不稳定蛋白；
亚细胞定位预测结果显示，PfNCED主要定位于叶绿体或细胞质(表2)。
2.2 白花泡桐NCED基因的进化树、保守基序和基因结构分析
根据PfNCED家族成员之间的进化关系，本研究将28个PfNCED基因分成4组，其中Ⅰ组包含16个基因，Ⅱ组包含6个基因，Ⅲ组和Ⅳ组分别包含3个基因(图1A)。
保守基序分析结果(图1B)显示，同一组内的PfNCED具有类似的基序组成。在Ⅰ组中，除PfNCED4 和 PfNCED22外，其他成员均包含motif2、4、5和7～9，并且这些motif在各成员中具有固定的排列顺序；
在Ⅱ组中，除PfNCED2 和PfNCED16分别缺少motif2和motif5,其他基因的基序组成呈现motif1～9固定排列的规律；
在Ⅲ组中，所有基因均包含motif3～6；
Ⅳ组的所有基因均包含motif3、6、9。保守基序分析结果显示PfNCED的基序组成在各组内具有高度的保守性，各组间又存在一定的差异，表明PfNCED家族在进化过程中可能发生了功能分化。
表2 白花泡桐NCED基因家族成员信息Table 2 Information of NCED gene family member in P. fortunei
A：基于PfNCED氨基酸序列的系统发育树；
B：PfNCED的基因结构；
C：PfNCED的保守基序，底部的刻度尺单位为aa，表示蛋白质的长度。
A: Phylogenetic tree based on the amino acid sequences of PfNCEDs; B: The exon-intron structure of PfNCEDs; C: The motif composition of PfNCEDs, and the bottom scale unit is aa, showing the protein length.图1 PfNCED的进化树、保守基序和基因结构分析Fig.1 Phylogenetic analysis, conserved motifs and gene structure of PfNCEDs
基因结构分析结果显示(图1C)，28个PfNCED基因中只有8个基因包含UTR，表明PfNCED基因功能间可能存在差异；
PfNCED基因中内含子的数量在0至13之间，其中PfNCED8、PfNCED12、PfNCED15、PfNCED22和PfNCED25没有内含子，PfNCED2有13个内含子，是所有PfNCED中内含子最多的。在Ⅲ组和Ⅳ组中，PfNCED不仅没有UTR，而且含有较多的内含子，暗示这些基因在转录过程中可能不稳定。
2.3 白花泡桐NCED基因的染色体定位与共线性分析
染色体定位分析显示28个PfNCED基因中的25个被定位到8条染色体上，其余3个PfNCED基因被定位到未组装的骨架上(图2)。PfNCED基因在染色体上的分布比较集中，具体表现为 7号和18号染色体上均有8个PfNCED，并且主要分布于染色体的两端。共线性分析(图2)结果表明，白花泡桐基因组中的PfNCED基因发生了5次基因复制事件，并且均为片段复制，片段复制事件可能在PfNCED家族的扩张过程中发挥重要作用。Ka/Ks值为选择系数，可以反映生物的进化趋势，当Ka/Ks>1，Ka/Ks=1和Ka/Ks<1分别代表在进化过程中基因承受正向选择、中性选择和纯化选择[33]。PfNCED家族中所有参与复制事件的基因对Ka/Ks值均小于1(表3)，表明在PfNCED家族进化过程中发生了较强的纯化选择。
2.4 白花泡桐NCED基因与其他物种间的进化树和共线性分析
为探究PfNCED的进化关系，本研究选择AtNCED和OsNCED基因与PfNCED构建进化树。进化树根据聚类结果被分为四组(Ⅰ～Ⅳ组, 图3)。复制基因对PfNCED12/PfNCED16、PfNCED13/PfNCED15与AtNCED3聚类在Ⅰ组中的同一分枝，暗示它们可能与AtNCED3具有相似的功能，此外，在Ⅰ组中PfNCED2和PfNCED25分别与AtNCED1和AtNCED6聚类在同一分枝；
复制基因对PfNCED11/PfNCED17与AtNCED8聚类在Ⅱ组中的同一分枝，表明它们可能与AtNCED8具有相似的功能；
PfNCED24与AtNCED4聚类在Ⅲ组中的同一分枝，表明二者功能相近；
Ⅳ组中只包含15个PfNCED，表明该组中的PfNCED与AtNCED和OsNCED的进化距离较远。
图2 PfNCED的染色体分布及家族成员间的共线性分析Fig.2 Chromosomal distribution and colinearity analysis of PfNCEDs
表3 PfNCED基因进化选择压分析Table 3 Analysis of evolutionary selection pressure of PfNCED genes
本研究分别分析了PfNCED与AtNCED(图4A)、PfNCED与OsNCED(图4B)的共线性关系。结果显示，在白花泡桐与拟南芥的共线性关系中，有10个PfNCED参与形成12个复制基因对；
在白花泡桐与水稻的共线关系中，有7个PfNCED参与形成9个复制基因对。该结果表明，与OsNCED相比，PfNCED与AtNCED的共线关系更密切。
2.5 白花泡桐NCED基因启动子顺式作用元件分析
为了进一步探究PfNCED的转录调控，本研究对PfNCED启动子顺式作用元件进行分析。结果显示，PfNCED的启动子区域包含光响应、植物激素响应、胁迫响应的顺式作用元件和参与调控植物生长过程的顺式作用元件(图5)。68%的PfNCED启动子区域含有茉莉酸甲酯或水杨酸响应顺式作用元件，79%的PfNCED启动子区域含有脱落酸响应顺式作用元件。其中，PfNCED2包含生长素、脱落酸和茉莉酸甲酯响应顺式作用元件；
PfNCED5包含脱落酸和茉莉酸甲酯响应顺式作用元件；
PfNCED13包含脱落酸和茉莉酸甲酯响应顺式作用元件；
PfNCED16包含生长素、赤霉素和脱落酸响应顺式作用元件；
PfNCED23包含脱落酸和茉莉酸甲酯响应顺式作用元件；
PfNCED24包含生长素、赤霉素、脱落酸和茉莉酸甲酯响应顺式作用元件；
PfNCED28包含生长素、赤霉素、脱落酸和茉莉酸甲酯响应顺式作用元件。推测这部分PfNCED基因主要参与脱落酸、茉莉酸甲酯或水杨酸调控通路。
图3 白花泡桐、拟南芥、水稻NCED蛋白的进化树分析Fig.3 Phylogenetic analysis of the NCED proteins of P. fortunei, A. thaliana and rice
注：不同物种基因对的共线关系用灰色线表示，PfNCED与其他基因的共线关系显示为红线。
A：PfNCED基因与AtNCED基因的共线性分析；
B：PfNCED基因与OsNCED的共线性分析。Note: The collinear relationship of gene pairs in different species was shown with the gray lines. The collinear relationship of PfNCEDs with other genes was shown with the red lines. A: Colinearity analysis of PfNCED genes with AtNCED genes; B: Colinearity analysis of PfNCED genes with OsNCED genes.图4 PfNCED与AtNCED、PfNCED与OsNCED间的共线性分析Fig.4 Colinearity analysis between PfNCED and AtNCED, PfNCED and OsNCED
2.6 白花泡桐NCED基因响应植原体侵染的表达模式分析
本研究在泡桐丛枝病发病模拟系统的基础上[34]，通过分析PfNCED基因在植原体侵染前后的转录组表达情况，发现28个PfNCED中有7个基因在PFI/PF差异显著，其中，PfNCED2、PfNCED5和PfNCED24表达显著上调，PfNCED13、PfNCED16、PfNCED23和PfNCED28表达显著下调(图6 A)。进一步分析了这7个PfNCED在30、100 mg·L-1利福平处理和30 mg·L-1利福平处理后恢复幼苗中的表达模式(图6 B)，发现PfNCED13、PfNCED16和PfNCED28的表达模式与泡桐丛枝病模拟系统中形态变化趋势一致，因此，推测这3个基因在泡桐丛枝病发生过程中可能具有重要作用。
图5 PfNCED基因启动子区域的顺式作用元件分析Fig.5 Cis-acting elements analysis in the promoter regions of PfNCED genes
为了验证RNA-seq数据，本研究随机选择5个PfNCED基因采用qRT-PCR方法分析了其在PF和PFI中的表达水平 (图6C)。qRT-PCR结果与RNA-seq结果一致，证明了RNA-seq数据的可靠性。
2.7 白花泡桐NCED蛋白互作网络的预测分析
为了进一步探究PfNCED的功能，本研究基于PfNCED与AtNCED的高度同源性，预测了PfNCED的互作蛋白(图7)。结果发现PfNCED 16与PfNCED 1可能有互作关系；
PfNCED1/11/16/25均与MAX2具有互作关系；
PfNCED1还与MEE3、D27和CYP711A1具有互作关系。在拟南芥中，CYP711A1和MAX2已被证明可以抑制腋芽的形成，而D27在调节分生组织形成[35-37]中发挥重要作用。因此，本研究推测PfNCED1/11/16/24/25可能调控腋芽的形成。进一步结合转录组分析，发现PfNCED16可能与泡桐丛枝病腋芽丛生相关。
泡桐丛枝病是由植原体侵染引起的病害，严重影响感病泡桐的生长速度和木材质量，制约泡桐产业的发展[38]。近年来，研究者已经发现一些与泡桐丛枝病发生相关的基因[21]，但是未见PfNCED基因家族的相关报道。为探究该家族基因响应丛枝植原体侵染的表达模式，预测其在丛枝病发生中的作用。本研究进行了生物信息学分析，在白花泡桐中共鉴定到28个PfNCED基因，比棉花(23个)[4]、烟草(18个)[39]、葡萄(12个)[40]等物种的NCED基因数量明显增加，推测在物种进化过程中PfNCED家族的扩张速度较快。同时发现PfNCED家族进化过程中共发生5次片段复制，通过计算复制基因对间的Ka/Ks值，发现该家族在进化过程中经历纯化选择。最后，结合转录组和蛋白互作分析，推测PfNCED16可能参与调控腋芽形成。
CANNON等[41]发现片段复制和串联重复是植物基因家族扩张和进化的主要原因，同源基因的序列、结构和表达的变化是功能分化的主要特征[42-44]。PRIYA等[45]通过比较48种植物的93个NCED基因发现，基因复制、功能分化和外显子内含子丢失事件促进了NCED家族进化。本研究中，PfNCED家族在进化过程中发生5次片段复制事件，且复制基因对之间在基因结构、编码氨基酸数量和响应植物原体感染的表达模式上有不同程度的差异，其中，PfNCED13/PfNCED15在基因结构上存在显著差异，PfNCED6/PfNCED22编码蛋白的氨基酸个数存在显著差异，PfNCED12/PfNCED16的表达模式存在显著差异，推测该家族在进化过程中可能发生了功能分化。
A：PfNCED基因在PF、PFI和Rif处理幼苗中的表达量；
B：PF/PFI中显著差异表达基因在30 mg·L-1Rif处理的PFI中的表达水平变化趋势， 1: PFIL30-5, 2: PFIL30-10, 3: PFIL30-15, 4: PF, 5: PFIL30R-10, 6: PFIL30R-20；
C：qRT-PCR验证结果。*表示P<0.05。
A: PfNCED genes expression in PF,PFI and Rif-treated PFI; B: The variation trend of differentially expressed genes in PF/PFI expression levels in 30 mg·L-1 Rif-treated PFI, 1: PFIL30-5, 2: PFIL30-10, 3: PFIL30-15, 4: PF, 5: PFIL30R-10, 6: PFIL30R-20; C: Results of qRT-PCR validation. * means P<0.05.图6 PfNCED基因的表达模式分析Fig.6 Expression pattern analysis of PfNCED genes
图7 蛋白质间的相互作用分析Fig.7 The analysis of protein-protein interaction
已有报道表明NCED参与调节植物腋芽的形成。水稻过表达OsNCED1的转基因株系中，植株分蘖减少[8]。拟南芥AtNCED3缺失突变体植株表现为腋芽增多[46]。本研究中发现PfNCED16与AtNCED3的同源性为66%，根据其在PFI和利福平处理的PFI中的表达模式以及蛋白互作预测结果，推测PfNCED16可能参与调控白花泡桐的腋芽形成。
本研究采用生物信息学方法对白花泡桐NCED基因家族成员进行鉴定和分析，共鉴定到28个NCED基因，结合泡桐丛枝病发生过程中NCED基因表达量的变化分析，最终发现7个PfNCED基因可能与泡桐丛枝病发生密切相关，其中PfNCED16可能参与调控分枝形成，其具体的功能可进一步通过转基因进行验证。
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