孟利 杜彩萍
（徐州医科大学，江苏省脑病生物信息重点实验室，生物化学与分子生物学研究中心，江苏徐州 221004）
神经型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase，nNOS）是一氧化氮合酶家族的成员之一，是一种广泛分布于神经细胞和非神经细胞中的催化酶，是一类结构类似于细胞色素P450还原酶的同工酶[1]。神经型一氧化氮合酶在NO合成过程中起着限速酶的作用。nNOS可以通过催化NO信号分子的产生进而在许多生理、病理过程中发挥重要作用，nNOS蛋白缺乏或者活性异常会引起一系列疾病[2-8]。我们前期的研究发现，蛋白质翻译后修饰SUMO化可以调节nNOS活性，并参与调节突触传递[9]。除了SUMO化，磷酸化也是调节nNOS活性的主要方式。nNOS的主要结构域包括位于氨基端的PDZ结构域，中间的ARG/HEAM/BH4结构域，钙调素结合（CaM）结构域，FMN结构域以及位于羧基端的FAD-NAPDH结构域[10]。
目前的研究发现，nNOS的CaM结构域可以通过与CaM结合来调节nNOS的活性，影响NO的生成，进而影响胞内一系列生化反应。nNOS的CaM结合结构域对其自身功能的发挥起着重要的作用[11-14]。为了进一步揭示nNOS的CaM结合结构域的作用，本研究构建CaM（nNOS）-pGEX-4T-1原核表达载体，并通过改变诱导剂IPTG（Isopropyl β-D-Thiogalactoside）的浓度及诱导的时间和温度，来获得高效表达的CaM（nNOS）蛋白，为进一步探究CaM结合结构域对nNOS的功能的影响提供了基础。
1.1 材料
（1）试剂PCR Master Mix、Wizard Plus SV Minipreps DNA Puri fi cation System、GeneClean、LB琼脂均购自上海生工生物工程有限公司；
限制性内切酶BamH Ⅰ、EcoRⅠ、T4 DNA ligase购自New England Biolabs公司；
LB培养基购自Invitrogen公司；
DL1000、DL2000、DL5000 DNA marker均购自Takara公司；
胎牛血清购自杭州四季青公司；
Plus Prestained Protein Ladder（26616，26619）购自Thermo公司；
抗GST蛋白的抗体购自Millipore公司。测序委托上海生工生物工程有限公司完成。
（2）细胞与质粒感受态细胞DH5ɑ、BL21购于上海生工生物工程有限公司；
nNOS-pME18S质粒由本室保存。
1.2 方法
（1）引物设计与合成，引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成。引物序列如表1所示。
表1 引物序列
（2）CaM-nNOS重组表达载体的构建 以nNOS（全长）-pME18S重组子为模板，PCR扩增CaM-nNOS cDNAs（2040bp～2400bp），用1.5%琼脂糖凝胶纯化目的基因。在连接酶的作用下与pGEM-T vector相连，连接产物转入感受态细胞DH5ɑ中，于大肠杆菌细胞中扩增。提取质粒经EcoR I、BamH I酶切，同时酶切pGEX-4T-1，回收纯化，将目的基因亚克隆入原核表达载体pGEX-4T-1。挑取阳性克隆，提取质粒经酶切鉴定后选取阳性重组子委托上海生工生物工程有限公司进行测序分析。
（3）蛋白的诱导表达将CaM-nNOS重组表达载体转化入BL21感受态细胞中，在LB培养基中扩增质粒至菌液在600nm的OD值约0.6～0.8时，加入不同浓度诱导剂IPTG，于16℃条件下诱导蛋白表达。
（4）免疫印迹检测蛋白的表达取1ml菌液离心获取菌体，加入100μl上样缓冲液1x laemmli Buffer，沸水浴5min变性处理。取20μl样品经10%SDS-PAGE分离后，电转到硝酸纤维膜（NC）膜上，3% BSA室温封闭2h～3h，用抗GST抗体（1:5000）孵育过夜，washing buffer（10 mmol/L Tris, 100 mmol/L NaCl, 0.1% Tween-20）洗膜5次，每次3min。加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔二抗工作液，室温孵育50min后，washing buffer洗膜（5min×5次），用超灵敏化学发光液显色，BioChem 化学发光仪曝光获取目的条带。
2.1 成功构建CaM-nNOS- PGEX-4T-1原核表达载体
nNOS的蛋白质结构如图1A所示。为了构建CaM-nNOSPGEX-4T-1原核表达载体，以全长nNOS-pME18S重组体为模板，加入上、下游引物，PCR扩增出目的基因，经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定发现，位于约400bp处有目的条带（见图1B），将经纯化后的PCR产物与pGEM-T vector在酶的作用下相连，连接产物转入感受态细胞DH5ɑ中，于大肠杆菌细胞中扩增，酶切后经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定发现，载体和目的条带分子量与预期一致（见图1C）。
图1 CaM-nNOS-pGEX-4T-1原核表达载体构建与鉴定。（A）nNOS蛋白的主要结构域示意图。（B）PCR产物的鉴定。（C）CaM-nNOS-pGEM-T vector经 EcoR I、BamH I酶切鉴定。（D）1、2, CaM-nNOS-pGEX-4T-1 未经酶切 ；
3、4,CaM-nNOS-pGEX-4T-1经EcoRI、BamHI酶切鉴定。M, DNA marker。
取测序正确的质粒及pGEX-4T-1原核表达载体分别采用EcoR I、BamH I酶切，胶回收纯化后在连接酶的作用下连接，连接产物转入感受态细胞DH5ɑ中，于大肠杆菌细胞中扩增，经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定发现，载体和目的条带都清晰（见图1D），以上结果表明，CaM-nNOS-pGEX-4T-1原核表达载体成功构建。
2.2 CaM-nNOS蛋白的诱导表达
采用IPTG诱导并检测CaM-nNOS蛋白的表达。将CaM-nNOS-pGEX-4T-1原核表达载体转入BL21感受态细胞中，再加入LB培养基扩增至菌液在600nm的OD值为0.6～0.8时，加入不同浓度的IPTG(0.25mmol/L，0.5mmol/L)于16℃诱导20h，采用SDS-PAGE来分离蛋白后，采用抗GST抗体免疫印迹，结果如图2所示，与GST空载体组及未诱导组相比，除了GST条带，诱导剂组出现目的条带；
且0.5mmol/L诱导剂组较0.25mmol/L组表达水平高，因此，蛋白诱导表达成功。
图2 CaM-nNOS蛋白表达的鉴定。免疫印迹鉴定在诱导温度为16℃，IPTG的浓度在0.25 mmol/L，0.5 mmol/L，诱导时间为20h，CaM-nNOS蛋白的表达。
前期研究表明，CaM是nNOS的变构激活蛋白。在外源刺激引起胞内Ca2+浓度升高时，可以促进钙调素蛋白（CaM）与nNOS的钙调素蛋白结合结构域相结合，从而引起nNOS的活化而发挥催化作用[11]。由此可见，CaM对 nNOS蛋白质活性及功能发挥极其重要。
目前，常用的体外蛋白表达载体主要有真核表达载体及原核表达载体。真核细胞常见表达载体为：pCDNA3.1载体、pAdTrack载体、pEGFP增强型绿色荧光蛋白表达载体、pSV2表达载体、CMV4表达载体等。而原核表达载体常用的主要包括pET系列、pGEX系列、pMAL系列等。根据实验需求及后续实验的开展来选择目标载体。
为了进一步探究nNOS钙调素蛋白结合结构域的作用，本实验构建了CaM-nNOS-pGEX-4T-1原核表达载体，与真核表达载体相比，主要优点体现在：原核细胞中诱导蛋白表达成本低、蛋白量大、所需时间短、便于操作。pGEX-4T-1载体带有GST标签，小分子蛋白可以与GST融合表达，便于后续蛋白表达的检测。蛋白可以采用GST柱子纯化，有利于后续蛋白互作等试验的开展。但是缺点在于，真核启动子在原核细胞中作用效率不高，如图2所示，虽然有表达，但是丰度不够。在蛋白分子量大的情况下，与GST融合表达容易引起蛋白表达不完整，表达出GST融合蛋白片段较多，真正的目的蛋白反而较少。本次实验构建的CaM-nNOS-pGEX-4T-1原核表达载体的表达效率不高，分析可能与这两个因素相关。
通过分子克隆技术构建了CaM-nNOS-PGEX-4T-1原核表达载体，并探索了其诱导表达条件，这为进一步开展nNOS相关研究提供了一定基础。
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