材料
1.1 药品与试剂 半枝莲购自安徽中医药大学第一附属医院，经安徽中医药大学天然药物化学教研室王举涛副教授鉴定为唇形科黄芩属植物半枝莲的干燥全草，根据文献所述方法[1]，制备半枝莲总黄酮，得率5.12%，经紫外分光光度法测定，总黄酮为75.6%，临用时，将TF-SB淡黄色粉末用生理盐水配成0.5%，1%及2%浓度的混悬液备用；雷帕霉素（Rapamycin，Rap，北京索莱宝科技有限公司，批号104C0316）；β-actin（Bioworld，批号AA24142）；兔抗大鼠LC3多克隆抗体（Abcam，批号GR252926-7）；NLRP3多克隆抗体（Abcam，批号GR306685-1）；caspase-1多克隆抗体（Bioworld，批号CJ44121）；IL-1β多克隆抗体（Bioworld，批号CN25141）；IL-18多克隆抗体（Abcam，批号GR194852-10）；IL-1β ELISA检测试剂盒（上海源叶生物科技有限公司，批号20170216）；IL-18 ELISA检测试剂盒（上海源叶生物科技有限公司，批号20170122）；RIPA细胞裂解液（碧云天生物技术研究所，货号P0013B）；SDS（Sigma公司，批号CAS：151-21-3）；Tris碱（Solarbio公司，批号1128Q0722）；PVDF膜（Millipore公司，批号K5CA1685L）。
1.2 仪器 KD-P组织摊片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司）；DHG-9070电热恒温鼓风干燥箱（上海三发科学仪器有限公司）；RT-6000酶标仪（雷杜生命科学股份有限公司）；JW3021HR高速台式冷冻离心机（安徽嘉文仪器装备有限公司）；GL-88B漩涡混合器（其林贝尔仪器制造公司）；DNP-9052BS-Ⅲ电热恒温箱（上海三发）；VE-180型电泳槽（Tanon）；VE-186型转膜仪（Tanon）；4X41RF显微镜（OLYMPUS）；JEDA801D形态学分析系统（江苏省捷达科技）。
1.3 动物及细胞株 SPF级C57BL/6J小黑鼠，雌雄各半，体质量20～22 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号SCXK（苏）2016-0003，合格证编号201703732，适应性饲养1周后，开始正式试验。温度20～25 ℃，湿度55%～65%，空调控制。B16-F1黑色素瘤细胞株，中国科学技术大学生命科学院赠送。
2 方法
2.1 人工接种B16-F1细胞株致小鼠黑色素瘤模型的制备[4] 将B16-F1细胞接种于含10%胎牛血清、青霉素100 U·mL-1、链霉素100 mg·L-1的RPMI-1640培养基中，置于37 ℃，5%CO2的培养箱内于饱和湿度条件下常规传代培养，收集对数生长期的细胞，经胰酶消化后制成浓度为1×107个/mL的单细胞混悬液进行实验。将上述细胞混悬液，按照0.1 mL/只接种于C57BL/6J小黑鼠右侧腋下，并于接种后每日观察小鼠右侧腋下是否长出肿块，大约于接种后的第4～5天，能观察到明显的肿块生长，用游标卡尺测量肿瘤长径和短径，筛选出50只短径至少在2 mm的小鼠进行分组、给药。
2.2 动物分组 取上述黑色素瘤模型小鼠50只，按照体质量和肿瘤体积大小，随机均分为模型对照组、阳性对照组（Rap，1.5 mg·kg-1）、TF-SB高（200 mg·kg-1，相当于生药含量3.91 g·kg-1，总黄酮为151.2 mg·kg-1）、中（100 mg·kg-1，相当于生药含量1.95 g·kg-1，总黄酮为75.6 mg·kg-1）、低（50 mg·kg-1，相当于生药含量0.975 g·kg-1，总黄酮为37.8 mg·kg-1）剂量组，每组10只。另取10只健康C57BL/6J小黑鼠作为正常对照组，以备血清检测时，作为正常对照使用。
2.3 给药方法 模型组和正常对照组每天灌胃生理盐水0.01 mL·g-1体质量，阳性对照组每天腹腔注射0.015%雷帕霉素溶液0.01 mL·g-1体质量，TF-SB高、中、低剂量组，分别灌胃2%，1%，0.5%的药液0.01 mL·g-1体质量，每天给药1次，连续2周。
2.4 肿瘤组织病理形态学的检测 颈椎脱臼处死小鼠，剥离荷瘤小鼠右側腋下肿瘤组织，用10%中性甲醛固定，石蜡包埋、切片，HE染色（修复、破膜、DAB显色、复染细胞核、脱水、封片），光镜下观察肿瘤组织病理形态学变化及坏死情况，并对肿瘤组织向周围侵犯情况、肿瘤组织坏死范围、炎细胞细胞浸润纤维组织反应等情况进行病理积分评定，见表1。
2.5 肿瘤细胞内自噬水平的检测 采用Western blot法检测肿瘤组织内LC3-Ⅱ及LC3-Ⅰ的蛋白表达水平，具体方法如下：剪取100 mg的肿瘤组织，加入1 mL的RIPA细胞裂解液，离心、收集上清液、提取总蛋白，经SDS-PAGE凝胶电泳，转膜，封闭，一抗孵育（LC3一抗按照1∶2 000稀释），二抗孵育（二抗使用HRP标记，按照1∶1万比例稀释），最后根据相关说明书，使用ECL发光试剂盒、暗室中显色，对LC3-Ⅱ及LC3-Ⅰ蛋白进行检测，最后采用北京科创锐新生物凝胶成像系统对实验结果进行分析。
2.6 肿瘤组织内NLRP3炎症小体激活情况的检测 采用Western blot法检测肿瘤组织内炎症小体NLRP3，caspase-1，IL-1β，IL-18的蛋白表达水平，NLRP3及caspase-1，IL-1β，IL-18一抗分别按照按照1∶500～1∶1 000进行稀释，其余检测方法同2.5项。
2.7 血清炎症因子IL-1β，IL-18含量的检测 末次药后30 min，包括正常对照组在内的所有小鼠眼眶采血0.5～1.0 mL，静置1 h，3 000 r·min-1离心15 min，分离血清，用于ELISA法检测炎症因子IL-1β，IL-18在血清中的含量。IL-1β，IL-18采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验测定，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行，最后在450 nm波长下，用酶标仪测定吸光度A，计算IL-1β，IL-18样品浓度。
2.8 统计学处理 实验结果以±s表示，采用SPSS 23.0软件对实验数据进行统计分析，将单因素方差分析运用于多组间比较，将独立样本t检验运用于2组间比较，P<0.05认为差异具有统计学意义。
3 结果
3.1 半枝莲总黄酮对肿瘤组织病理形态学的影响 肉眼观察：模型组小鼠体积最大，阳性对照组及TF-SB各剂量组肿瘤体积明显缩小，且阳性组与药物组之间差异不明显。
镜下观察：模型组肿瘤组织边界不清、呈片状弥散分布，瘤组织与间质无明显界限，肿瘤细胞向周围组织侵犯，细胞排列密集，呈短梭形、多边形或卵圆形，且胞体较大、形状不规则、胞浆丰富，嗜伊红染核是类圆形，深染，核分器易见，细胞核明显增大，呈明显异型性及恶性增殖的特点，间质血管较丰富，坏死较少，且有不同程度炎细胞浸润。雷帕霉素组及TF-SB各剂量组肿瘤细胞形态与模型组基本相似，但肿瘤细胞密度明显稀疏，肿瘤细胞部分溶解、破碎，细胞核体积较小、着色较浅，且肿瘤组织中心及边缘可见不同程度的出血及凝固性片状或灶性坏死。病理组织学积分统计显示：雷帕霉素组及TF-SB各剂量组（200，100，50 mg·kg-1）肿瘤组织向周围侵犯情况明显减轻、肿瘤组织出现不同程度的坏死、范围明显增大，炎细胞浸润及纤维组织反应明显减轻，与模型组比较有显著性差异（P<0.05，P<0.01或P<0.001），见表2，图1。
3.2 半枝莲总黄酮对肿瘤细胞内自噬水平的影响 雷帕霉素组及TF-SB各剂量组LC3-Ⅱ于LC3-Ⅰ的相对表达量明显增加，表明肿瘤细胞内自噬水平较高，其中雷帕霉素组及TF-SB高剂量组与模型组比较有极显著性差异（P<0.001），TF-SB中、低剂量组与模型组比较有显著性差异（P<0.05或P<0.01），见图2。
3.3 半枝莲总黄酮对肿瘤组织内NLRP3炎症小体激活情况的影响 模型组肿瘤细胞内炎症小体 NLRP3及caspase-1，IL-1β，IL-18的蛋白表达较多，表明肿瘤组织内炎症小体NLRP3处于激活状态；雷帕霉素组肿瘤组织内炎症小体NLRP3及caspase-1，IL-1β，IL-18明显减少，与模型组比较有显著性差异（P<0.01或P<0.001）；TF-SB各剂量组（200，100，50 mg·kg-1）同样明显抑制NLRP3炎症小体的表达，使caspase-1，IL-1β，IL-18表达明显减少，与模型组比较有显著性差异（P<0.05或P<0.01），见图3。
3.4 半枝莲总黄酮对荷瘤小鼠血清IL-1β，IL-18含 量的影响 模型组小鼠血清IL-1β，IL-18含量明显升高，表明荷瘤小鼠血清处于炎症状态，与正常对照组比较有极显著性差异（P<0.001）；雷帕霉素组血清IL-1β，IL-18水平明显降低，与模型组比较有极显著性差异（P<0.001）；TF-SB各剂量组（200，100，50 mg·kg-1）亦可降低荷瘤小鼠血清IL-1β，IL-18含量，与模型组比较有显著性差异（P<0.05，P<0.01或P<0.001），见表3。
4 讨论
在本课题组前期分别观察了肿瘤生长曲线、肿瘤质量、抑瘤率及肿瘤细胞凋亡等主要药效学指标[1]，本研究通过HE染色、观察肿瘤组织病理形态学的改变及坏死情况，进一步验证了半枝莲总黄酮的抗肿瘤作用，结果显示，半枝莲总黄酮各剂量组（200，100，50 mg·kg-1）可明显改善肿瘤组织的病理形态学，减轻其恶性增殖的特性及炎症状态，肿瘤 组织出现坏死，与文献报道及前期研究结果一致。
NLRP3炎症小体是细胞内一种由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis-associated spot-like protein，ASC）以及半胱氨酸蛋白酶（caspase-1）所共同組成的多蛋白聚集体，氧化应激、免疫反应、微生物感染等都可以作为一种危险信号促进NLRP3炎症小体的激活，将caspase-1前体（pro-caspase-1）剪切成具有较强生物学活性的caspase-1 P10片段，从而促进下游pro-IL-1β和pro-IL-18转化成具有活性的IL-1β和IL-18等炎症因子[5]。研究表明，肿瘤的发生除与遗传因素、免疫异常、基因突变等多种因素有关以外，也与肿瘤细胞生长微环境的慢性炎症状态密切相关[6]。而NLRP3炎症小体作为导致炎症反应的重要环节之一，对肿瘤的发生、发展、转移以及预后将产生重要的影响。研究表明，炎症小体通过NLRP3/caspase-1轴释放的IL-1β，IL-18等炎症因子可以促进肿瘤的发生，IL-1β，IL-18在肿瘤组织中是高表达的，以自分泌或旁分泌的方式控制肿瘤的生长，并且通过介导内皮黏附因子、肿瘤细胞表面趋化因子等高表达，从而促进肿瘤的生长及转移[7]。本研究结果显示，半枝莲总黄酮各剂量组明显抑制炎症小体NLRP3/caspase-1轴的激活，使IL-1β，IL-18在肿瘤局部及循环血液中表达均明显减少，说明半枝莲总黄酮可通过抑制NLRP3炎症小体的激活，改变了肿瘤生长的微环境，从而抑制了肿瘤的生长，这与药效学的研究结果也是一致的。
细胞自噬是溶酶体的主要降解途径之一，LC3常作为一种标志蛋白用来检测自噬活性，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ代表着细胞自噬的表达水平[8]。因此，在本研究中，在重新复制模型及给药处理的基础之上，同样观察到了对肿瘤细胞自噬的诱导作用，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ明显升高，与模型组比较具有显著的统计学意义，因此更加确定了半枝莲总黄酮诱导肿瘤细胞发生自噬的作用。研究表明，细胞自噬对炎症小体的激活也存在着精细的调控作用，二者相互影响，主要表现为细胞自噬对炎症小体的激活起着负性调控作用[9]，例如多项研究证明在自噬基因Atg16L1缺陷的巨噬细胞内，NLRP3炎症小体的产物IL-1β，IL-18分泌量显著的增加；而在自噬诱导的模型中，NLRP3炎症小体则明显被抑制，IL-1β，IL-18表达明显减少。并且，细胞自噬通过对某些蛋白质、细胞器、病原体等进行自我消化的过程，可以将NLRP3炎症小体的某些组分（如NLRP3，ASC，caspase-1等）隔离开来，从而抑制了NLRP3炎症小体的活化过程。结合本研究结果来分析，半枝莲总黄酮对炎症小体NLRP3，caspase-1，IL-1β，IL-18激活的抑制作用，可能与其诱导肿瘤细胞发生自噬有关。
综上所述，本研究发现半枝莲总黄酮具有明显的抗肿瘤作用，其机制可能与通过诱导细胞自噬从而抑制NLRP3炎症小体的表达、改变肿瘤生长的微环境有关。但是，同时也存在一些困惑，例如也有报道显示炎症小体的活化可以诱导肿瘤前体细胞的凋亡，因此具有抗肿瘤作用；自噬也可以正向调控炎症小体的表达[10]；自噬到底通过什么途径调控NLRP3炎症小体的表达、活性氧簇（ROS）在这个过程中又发挥什么样的作用，这些都需要进一步去研究和探索。
[参考文献]
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[3] 张礼刚，陈先国，梁朝朝. 细胞自噬与炎症小体相互作用的研究进展[J].临床泌尿外科杂志，2015，30（9）：859.
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[5] 王振磊，孙萍萍，李天晓，等. 白头翁汤激活NLRP3炎症小体治疗炎症性肠病的研究[J].中药材，2012，35（8）：1280.
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[責任编辑 张宁宁]
