林飞飞，蒋贤国，刘秋菊，江明华
1.温州医科大学附属苍南医院 输血科，浙江 温州 325800；
2.温州医科大学附属第二医院育英儿童医院 医学检验中心，浙江 温州 325027
目前国际输血协会（International Society of Blood Transfusion, ISBT）发现并正式命名的红细胞血型系统有43个，包含了345个红细胞抗原[1]。
MNS血型系统（ISBT编号002）是继ABO血型系统之后发现的第二个血型系统，其复杂性仅次于Rh血型系统[2]。我国目前对稀有血型系统的关注相对较 少，而欧美等多数发达国家已将MNS血型系统列入常规的检测项目[3]。MNS血型系统的同种抗体特异性反应可导致血型鉴定困难、交叉配血不相容和输血反应等，同时在器官移植、法医学鉴定等方面均有着重要的应用[4-6]。人类红细胞血型抗原会因社会变迁、地理位置、人种特征等有所差异。畲族是温州地区人口最多、分布区域最广的少数民族，调查畲族人群的红细胞血型抗原分布情况，对丰富和完善温州苍南地区血型资源数据库以及畲族患者的临床用血、器官移植中心的组织配型等有重要意义。本研究对122名温州苍南地区畲族人进行MNS血清学抗原分析和基因频率调查。
1.1 对象 收集2021年10月至2022年4月温州医科大学附属苍南医院苍南地区三代以内无血缘关系的畲族健康志愿者122名，其中男53例（36～87岁），女69例（30～85岁），平均年龄为（64.9±11.3）岁。每位志愿者采集EDTA抗凝静脉全血3～5 mL进行MNS表型鉴定，并提取DNA，于-20 ℃保存。参与研究的人员均签署了知情同意书，且经温州医科大学附属苍南医院伦理委员会审批（苍医伦理第2022074号）。
1.2 试剂与仪器 单克隆IgM血清Anit-M、Anit-N、Anit-S、Anit-s均由上海血液生物科技有限责任公司提供（批号20210104）；
DNA提取试剂盒（批号202112003）和人类红细胞MNSs基因分型测定试剂盒（SSP荧光PCR染料法，批号K202206004）均由天津秀鹏生物技术开发有限公司提供。实时荧光定量PCR仪（杭州博日科技股份有限公司），涡旋混匀器（海门其林贝尔仪器制造有限公司），高速离心机（德国Sigma公司）。
1.3 方法
1.3.1 MNS血清学分型检测方法：取洁净小试管，加入单克隆抗体试剂50 μL与受检者2%～4%红细胞悬液50 μL于试管中混匀，室温（20～25 ℃）孵育15 min，将试管于1 000×g离心15 s后轻轻摇动，观察是否凝集判读结果。
1.3.2 基因组DNA提取：严格按照全血DNA提取试剂盒说明书操作提取样本DNA，使用浓度为20～ 40 ng/μL，A260/A280值为1.6～2.0。
1.3.3 PCR方法扩增体系：严格按照人类红细胞MNSs基因分型测定试剂盒说明书操作。通过针对红细胞MNS血型系统基因设计特异性引物（见表1）。反应条件按要求设定PCR仪循环参数：96 ℃预变性2 min；
96 ℃变性20 s，68 ℃退火60 s，5个循环；
96 ℃ 20 s，65 ℃ 50 s，72 ℃ 45 s，10个循环；
96 ℃ 20 s，62 ℃ 50 s，72 ℃ 45 s，15个循环；
72 ℃延伸2 min，4 ℃保存。工作反应液用量（每人份样本）=4 μL DNA+40 μL dNTP-Buffer II工作液。每孔各加入10 μL上述混合液，加入15～20 μL石蜡油，盖好反应管；
将引物板放入已经设置好参数的PCR仪内，并启动PCR程序扩增，直到循环结束。
表1 MNS血型系统PCR-SSP引物序列
1.3.4 基因检测结果分析：根据每孔的最高熔解曲线Tm值判断孔位阴阳性，Tm值见表2。
表2 MNS血型基因型Tm值
1.4 统计学处理方法 采用SPSS25.0统计软件进行数据分析。用χ2检验验证基因频率是否符合Hardy-Weinberg遗传法；
基因频率=某基因的纯合子频率+1/2杂合子频率；
用χ2检验分析基因频率的差别。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 温州苍南地区畲族人群MNS血型系统的等位基因频率 M=0.566、N=0.434、S=0.037、s=0.963，MNS血型系统符合Hardy-Weinberg遗传法则（P＞0.05），见表3。
表3 温州苍南地区畲族人群MNS血型基因频率调查结果（n=122例）
2.2 MNS血型系统基因型的荧光PCR熔解曲线 温州苍南地区畲族人群当Tm值在阳性温度范围出现特征性熔解曲线峰，等位基因M阳性Tm值为79 ℃，等位基因N阳性Tm值为78 ℃，等位基因S阳性Tm值为78 ℃，等位基因s阳性Tm值为78 ℃，可得到MNSs基因型（见图1）。
图1 MNS血型系统基因型的荧光PCR熔解曲线
2.3 不同地域MNS血型系统等位基因频率分布比较 温州苍南地区畲族人群与中国内蒙古、湖南、陕西、新疆、西藏、四川等地区随机人群的MNS血型基因频率比较结果显示，温州苍南地区畲族人群MN等位基因频率与西藏藏族差异有统计学意义（P＜0.05），与其他地区民族差异无统计学意义（P＞0.05）；
温州苍南地区畲族人群Ss等位基因频率与新疆维吾尔族、哈萨克族和西藏藏族差异有统计学意义（P＜0.05），与其他地区民族差异无统计学意义（P＞0.05）；
见表4。
表4 温州苍南地区畲族人群MNS血型系统等位基因频率与国内其他民族人群的分布比较
MNS血型系统已被血清学证明包括至少46个血型抗原，受控于第4号染色体（4q28-31）上的MN和Ss两个连锁的基因，在临床输血和遗传学研究中意义较大的分别为M、N、S、s抗原，其余大多数是低频率或高频率抗原。M和N是等位基因，组成MM、MN、NN 3种基因型，表现出M、MN、N 3种表现型。S和s是等位基因，组成SS、Ss、ss 3种基因型，表现出S、Ss、s 3种表现型。临床上血型抗原的不配合输注，容易刺激机体产生不规则抗体，不规则抗体主要以Rh和MNS为主[18]。近年来，因抗-M抗体引起的严重胎儿水肿和复发性流产以及新生儿溶血病的报道越来越多[19-21]。以上分析提示临床MNS血型不合所引起免疫反应的输血风险不容忽视，有必要考虑输血前鉴定患者的MNS血型。不同种族和地域对MNS血型系统的差异性存在影响，了解畲族人群MNS血型系统表现型分布特点及其基因频率可为红细胞稀有血型库建设提供一定的数据支持。
本研究使用荧光PCR方法完成了122名温州苍南地区畲族人群MNS稀有血型系统的基因型检测。本方法基于单核苷酸熔解温度差异而形成不同形态熔解曲线，通过对特征性熔解曲线Tm值判断分型结果。该方法具有较高的灵敏度，可以检测出单个碱基的差异，操作简单，检测时间短，且减少了PCR产物交叉污染的可能性。研究发现本地区畲族人群MNS血型系统的M等位基因频率0.566，N等位基因频率0.434，S等位基因频率0.037，s等位基因频率0.963。基因型以MN为主，占62.30%（76/122），MM型次之，占25.41%（31/122），NN型占12.29%（15/122）；
基因型ss占92.62%（113/122），Ss占7.38%（9/122），s占主导地位，未检测到SS基因型。M等位基因频率（0.566）与西藏藏族（0.681）差异有统计学意义，与内蒙古蒙古族（0.609）、四川彝族（0.683）和其他地区汉族差异无统计学意义。N等位基因频率（0.434）低于湖南汉族（0.502）、西安汉族（0.470）、新疆回族（0.480），但又高于蒙古族（0.391）、新疆哈萨克族（0.355）。S等位基因频率（0.037）低于新疆维吾尔族（0.173）、新疆哈萨克族（0.143）和西藏藏族（0.147），且差异有统计学意义，s等位基因频率（0.963）明显高于新疆维吾尔族（0.801）、西藏藏族（0.853），但低于四川凉山彝族（0.980）。M、N基因在畲族与其他地区人群相比，基本上是M基因频率低于南方民族，略高于北方民族，S基因频率低于其他民族，处于低水平状态。出现差异的可能原因是新疆维吾尔族、哈萨克族和西藏藏族在中国地理位置处于西北方，畲族主要分布在长江以南，民族迁移、地理位置和生态环境造成基因频率的差异。另外，本次调查研究与温州本地汉族人群MN血型基因频率（M=0.537，N=0.463）非常接近[22]，可能是地域相近，互相通婚的原因。本研究采用χ2检验法比较基因表现型的观察值与期望值的差异，得到MNS稀有血型系统的基因频率分布符合Hardy-Weinberg遗传平衡法则。本研究发现温州苍南地区畲族人群MNS血型系统的MN血型基因频率符合少数民族M＞N的遗传规律[22]，且与当地汉族人群有逐步同化趋势，但与其他少数民族相比仍具有自身特点。
有研究表明：感染疑似病毒/细菌的患者会改变其免疫原性产生抗-M[23]。MN基因定型检测在器官移植早期检测、法医学鉴定等方面均有应用。因此，MNS血型系统检测及基因频率调查对于血型与疾病相关性研究也具有重要意义。目前浙江省稀有血型献血者资料库主要是以Rh（D）抗原阴性的资料为主，其他的稀有血型资料库有待于进一步完善。本研究为本地区畲族人群红细胞稀有血型库的建设提供数据支持，有利于建立相应的血源库，为畲族人群血液学研究、民族迁移、器官移植配型等方面提供了支撑，并对本地区血型鉴定结果的准确性和临床输血安全等方面具有重要的临床指导意义。人类红细胞血型抗原的地域性特征比较明显，可能还有相关基因的碱基突变未被发现，有待增加标本量对温州地区畲族人群的血型系统进行更深入广泛的研究。
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