朱栋栋
近年来，各地多次考查重叠延伸PCR、大引物PCR等新型PCR技术，但不少一线教师对其理解不够透彻。除此之外，重组PCR、环状质粒PCR等也能对基因进行定点诱变，其原理不完全相同，使用情境也各有侧重。本文以基因定点突变技术为线索，将相关的几种PCR技术串联在一起，帮助一線教师拓展视野，并提供教学素材。
1 基因定点突变技术的研究意义
人类很早就意识到基因突变、基因重组等可遗传变异对进化的重要作用，但是传统的基因突变和基因重组具有不定向性，极大地延长了基因向人类需求进化的时间。转基因技术和基因定点突变技术能够分别实现基因定向重组和基因定向突变。同时，由于当前科学界尚未建立能精确预测特定氨基酸残基变化对整个蛋白质结构及活性影响的模型，对氨基酸定点突变存在一定的盲目性，所以基因定点突变是目前科学家进一步了解蛋白质结构与功能的重要手段。
2 基于PCR的基因突变技术
基因突变容易发生于DNA的复制期间。早在20世纪70年代，就有科学家通过诱变引物建立了体外寡核苷酸介导的 DNA 突变技术。随着 PCR 技术的兴起，基因突变技术得以丰富和发展。目前，基于PCR的基因突变技术主要有两种思路：第一种是利用TaqDNA聚合酶的缺陷，通过限制某种脱氧核苷酸的含量而引起错误配对。第二种是在引物的5端引入突变碱基，或者增加或减少一个或多个碱基，通过PCR大量扩增突变DNA。两种思路相比较而言，第二种能更为准确地实现基因的定点突变，故下文主要讨论第二种思路。
3 基于PCR的基因定点突变技术
3.1 重叠延伸PCR
重叠延伸PCR需要设计两对引物：上游引物a、突变引物b以及下游引物d、突变引物c。其中突变引物b和c加入了突变碱基，且具有重叠区域，如图1所示，引物中突变碱基处用“·”表示。第一、二轮PCR时（即图1中PCR1和PCR2）分别用引物a、b和引物c、d在两个PCR体系中扩增出突变碱基上游片段AB和下游片段CD。此时，AB和CD都携带突变碱基，但不具有完整的DNA长度。由于这两个片段具有重叠区域，将其置于一起时能局部配对并延伸，再通过上游引物a和下游引物d进行PCR可以扩增出大量含有突变碱基的DNA，即AD。
与单突变引物法相比，重叠延伸PCR能将突变碱基加入至DNA的内部。但是这种方法往往需要三轮PCR才能获得产物，过程繁琐。有学生提出如下解决方案：在上述设计基础上做出改进，将突变碱基置于两种突变引物（即b和c）的5端的第一个碱基位置，如此突变引物b和c就不必重叠，则可以在一个试管中同时完成两轮 PCR 反应，再用引物 a 和 d 大量扩增。经思考讨论后学生发现该方案不可行：该方法得到的上游片段AB和下游片段CD重叠区域仅有一个突变碱基，重叠延伸阶段无法稳定有效的复性，所以突变引物携带的错配碱基应位于中央位置。
3.2 大引物PCR
由于重叠延伸PCR需要三轮PCR才能获得大量突变DNA，多轮PCR因引物的改变要将PCR产物进行试管的转移，而这种转移容易造成样品遭受环境污染。有学者巧妙地设计出只需要两轮PCR即可获得突变DNA的方法，即大引物PCR法。
在大引物PCR反应体系中，先加入上游引物和突变引物（图2），以扩增出含有突变碱基的部分DNA片段，然后以此DNA片段的一条链作为大引物，配合下游引物扩增出含有突变碱基的完整DNA。
大引物PCR的巧妙之处在于摒弃了在突变碱基上下游分段、分别PCR的思路，将第一轮PCR出的产物作为第二轮PCR的引物，直接获得了突变DNA。但是这种方法依旧存在试管转移的问题。有学者提出，可以将第二轮PCR中下游引物长度设计地比第一轮上游引物长一些，这样就可以通过适当提高退火温度以抑制上游引物在第二轮中与模板链的结合。笔者在绘制图2时还产生了一个疑问：
“突变引物应更接近近端侧还是远端侧？”经过思考不难得出，因为第一轮扩增产物作为第二轮PCR的大引物，根据引物不宜太长原则，所以应该接近近端侧。
3.3 重组PCR
对于环状DNA，尤其是质粒而言，重组PCR不失为一个可行的基因定点突变的方法。其基本思路如下：先用限制性核酸内切酶将质粒模板切成线性DNA（即线性化）。在一个PCR体系中用引物1和含突变碱基的引物2扩增出带突变碱基的DNA片段，在另一PCR体系中以与引物1、2互补的引物3和4扩增出另一种带突变碱基的DNA片段。因为两个PCR体系中选择的引物互补，扩增出来的两种DNA的两端具有同源序列，将其导入大肠杆菌体内会发生同源重组，形成含突变碱基的环化质粒。
这种技术巧妙地通过引物设计扩增出具有同源序列的1/2线性化质粒模板DNA，通过共转化、同源重组，形成含突变碱基的突变质粒。为什么要将质粒模板线性化后再分别PCR呢？理论上环状DNA可以直接PCR，但实践表明这种方式得到的PCR产物中含有较多扩增出来的质粒模板，需要纯化。而且直接以环状DNA为模板扩增，需要更多次数的循环。这是因为与线性DNA模板相比，直接以环状DNA为模板扩增的效率更低。
3.4 环状质粒PCR
科学研究发现，利用寡核苷酸介导的DNA突变会产生大量非突变DNA，主要原因是部分质粒会逃避突变。于是学者们开发出体外选择性破坏非突变DNA的方法，如Dpn Ⅰ酶切法。Dpn Ⅰ是一种限制性核酸内切酶，它能识别并酶切DNA双链中腺嘌呤N6位甲基化（N6-methyladenine）的GATC序列。Dpn Ⅰ识别位点中两个腺嘌呤的N6位都甲基化时，呈现正常的酶活力，只有一个腺嘌呤的N6位甲基化时，酶切活力会降低约60倍。从大肠杆菌中分离的质粒已在内源性Dam甲基化酶的作用下被完全甲基化了，少数Dam缺陷型大肠杆菌可用Dam甲基化酶进行体外甲基化，而PCR合成的DNA没有甲基化。
如图4 所示，在 PCR 体系中加入含突变碱基的引物和正常引物，扩增出的 DNA 包括：一条链含突变碱基的 DNA（产物 1）、两条链均含突变碱基的DNA（产物2）、两条链均不含突变碱基的DNA（产物3）。利用Dpn Ⅰ选择性地切断两条链均不含突变碱基的DNA和一条链含突变碱基的DNA，利用Dpn Ⅰ也可切除这种 DNA 中未甲基化的母链，但效率较低，所以处理时间应相应延长，且断裂的 DNA 不稳定，很容易被水解。最后将两条链均含突变碱基的DNA导入感受态的大肠杆菌中，大肠杆菌会将其环化并大量复制。
當然，该方法存在因正常引物扩增出大量不含突变碱基的DNA，而且Dpn Ⅰ切除不彻底，导致获得的突变DNA阳性率低的问题。据此有研究人员提出用含突变碱基的单引物进行PCR，即单引物PCR法。主要思路如下（图5）：先用含突变碱基的单一引物对质粒模板进行不对称PCR，经过一轮扩增获得了一条链含有突变碱基的双链DNA（产物1）和一条置换出来的亲代单链DNA（产物2）。在第二轮循环中，含突变碱基的单一引物只能和上述三条链中的一条链（即第一轮的模板链）配对。如此循环下去，获得了较多的含突变碱基的单链DNA（产物3）。然后加入Dpn Ⅰ短时间处理，破坏甲基化的母链。最后转化感受态大肠杆菌，在其体内完成双链复制并环化（产物4）。
单引物PCR法阳性率高，足以获得带有目的突变的DNA。但需要注意的是，该方法对突变DNA链进行线性扩增，扩增效率较低。目标DNA链到达一定的量后可以将其导入大肠杆菌体内进行指数扩增，以获得大量突变DNA。
4 小结
以PCR为基础的突变方法优点很多，如突变效率高、可以任意定点诱变、快速简单等。如果对需要改造蛋白质结构功能信息很明确，就可以用上述方法设计一系列突变体，通过重叠延伸PCR、大引物PCR、重组PCR和环状质粒PCR等方法构建出定向突变体。
另外，构建融合蛋白时，也可以采用重叠延伸PCR和重组PCR等方法。
参考文献：
［1］ 朱玉贤.现代分子生物学［M］.北京：高等教育出版社，2019：208.
［2］ 黄留玉.PCR最新技术原理、方法及应用［M］.北京：化学工业出版社，2010：82.
［3］ 彭向雷，王烨等.单引物PCR法引入定点突变［J］.中国生物工程杂志，2020 （08）：19-23.
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