曹影丽 刘琪 柴震震 杨侃侃 梁月巧 宋祥军 邵颖 涂健 祁克宗
摘要：
cGAS作為一种新型的胞质DNA受体，在宿主抵抗DNA病毒而触发的天然免疫中起着至关重要的作用。血清4型禽腺病毒（Fowl adenovirus serotype 4，FAdV-4）是无囊膜的一种双链DNA病毒，可引起鸡肝炎-心包积液综合征。为明确鸡cGAS（chcGAS）基因功能，探究在鸡肝癌（LMH）细胞中过表达chcGAS以及FAdV-4感染前后细胞定位的变化情况。本研究针对chcGAS序列设计引物进行PCR扩增，并分析该基因序列与其他物种之间的同源性以及预测该基因的结构域，构建重组质粒pET-32a-chcGAS进行原核表达，通过SDS-PAGE和Western blot鉴定，利用激光共聚焦观察FAdV-4感染LMH细胞前后chcGAS细胞定位变化。结果表明，本试验克隆得到大小为1 317 bp的 chcGAS基因，与其他物种同源性为50.5%～84.4%，SDS-PAGE分析结果显示，chcGAS蛋白主要以可溶性蛋白质的形式在上清液处表达，目的蛋白质相对分子质量为75 000，与预期大小相符。亚细胞定位结果显示，FAdV-4感染可导致定位于细胞核膜上的chcGAS蛋白转移到细胞质中。本研究结果为进一步研究FAdV-4与cGAS-STING信号通路的关联调控机制提供了科学依据。
关键词：
cGAS；
血清4型禽腺病毒（FAdV-4）；
序列分析；
原核表达；
亚细胞定位
中图分类号：
S831 文献标识码：
A 文章编号：
1000-4440（2023）02-0453-08
Cloning and expression characteristics of chicken cGAS gene and changes in subcellular localization before and after FAdV-4 infection
CAO Ying-li， LIU Qi， CHAI Zhen-zhen， YANG Kan-kan， LIANG Yue-qiao， SONG Xiang-jun， SHAO Ying， TU Jian， QI Ke-zong
（Anhui Key Laboratory of Veterinary Pathobiology and Disease Control/Anhui Province Animal Food Quality and Biosafety Engineering Laboratory， Hefei 230036， China）
Abstract：
cGAS plays a key role in the hosts innate immune response against DNA viruses as a receptor for DNA recognition within the cytoplasm. Fowl adenovirus serotype 4 （FAdV-4） is a double-stranded DNA virus without an envelope， and can cause hepatitis-pericardial effusion syndrome in chicken. In order to clarify the function of chicken cGAS （chcGAS） gene， the overexpression of chcGAS in chicken liver cancer （LMH） cells and the changes of cell location before and after FAdV-4 infection were investigated. In this study， the primers were designed according to the chcGAS sequence， and the chcGAS gene was amplified by PCR. The homology between the gene sequence and other species was analyzed， and the domain was predicted. The recombinant plasmid pET-32a-chcGAS was constructed for prokaryotic expression， identified by SDS-PAGE and Western blot， and the localization changes of chcGAS in LMH cells before and after FAdV-4 infection were observed by laser confocal microscopy. The results showed that the chcGAS gene with a size of 1 317 bp was successfully cloned， and the homology with other species was 50.5%-84.4%. The results of SDS-PAGE analysis indicated that chcGAS protein was mainly expressed in the supernatant in the form of soluble protein. The relative molecular mass of target protein was 75 000， which was consistent with the expected size. The results of subcellular localization showed that FAdV-4 infection could lead to transfer of chcGAS protein localized on the nuclear membrane into the cytoplasm. These results can provide a scientific basis for further studying the correlation regulatory mechanism between FAdV-4 and cGAS-STING signaling pathways.
Key words：
cGAS;fowl adenovirus serotype 4（FAdV-4）;sequence analysis;prokaryotic expression;subcellular localization
当外界的病原微生物或其产物进入机体时，细胞内的模式识别受体（PRRs）活化，进而产生I型干扰素（IFN）和一些促炎细胞因子[1-3]。在过去的几年里，模式识别受体研究领域将胞质DNA感受器作为重要研究方向[4-6]。PRRs是一类天然免疫分子，是天然免疫受体识别的重要组成部分[7-8]。2013年Wu等[9]发现细胞中存在某种物质可以通过识别胞质内的DNA激活IFN-β信号通路，质谱检测分析后发现是一种新的物质，这种物质为环磷酸鸟苷-腺苷（cGAMP），并且该物质可以通过与干扰素刺激基因（STING）结合从而激活IFN信号通路。也有研究结果表明，cGAS可以作为一种广谱胞质DNA受体识别胞质内DNA并激活IFN信号通路[10]。常规情况下，细胞质内存在的DNA较少，故以cGAS为主的胞质DNA感受器处于未活化的状态。但当细胞处于某些应激状态时，比如DNA病毒感染，其胞质内的DNA含量上升，随后可通过cGAS-STING通路发挥抗病毒作用。目前，普遍认为cGAS定位于细胞质中，而Barnett 等[11]指出，cGAS并非传统意义上的胞质蛋白质，而是通过其N端磷酸肌醇结合域的作用从而出现膜定位的一种蛋白质，并提到在静息状态下，cGAS定位在细胞膜，而识别DNA病毒感染后可出现由细胞膜到细胞质转位的现象。
目前，关于鸟类中cGAS的研究也有报道。杨洁[12]的研究结果表明，cGAS和STING信号轴对DNA病毒、RNA病毒和反转录病毒均有抗病毒作用，证明其广泛的抗病毒功能和在鸡先天免疫中的关键作用。Oliveira 等[13]的研究结果表明，在鸡巨噬细胞中，cGAS/STING通路不但能产生I型干扰素以响应细胞内DNA刺激，而且对调节巨噬细胞效应器功能[包括组织相容性复合体（MHC-II）和共刺激分子的表达]至关重要。在禽痘病毒（一种禽DNA病毒）感染的情况下，发现cGAS/STING途径与I型干扰素的产生及MHC-II转录有关。禽腺病毒4型属于腺病毒科禽腺病毒属，是无囊膜的双链 DNA 病毒。血清4型禽腺病毒（FAdV-4）是肝炎-心包积液综合征的主要病原体。作为一种DNA病毒，目前Wang等[14]通过在鸡胚成纤维细胞（CEF）中瞬时转染鸡cGAS基因（chcGAS）来研究其亚细胞定位，结果表明，chcGAS主要定位在细胞质中。通过过表达chcGAS基因和RNA干扰chcGAS基因，证明了chcGAS对外源性双链DNA（dsDNA）以及来自DNA损伤反应的自身dsDNA有反应，从而激活了STING/TBK1/IRF7介导的先天免疫。目前，对于 chcGAS的研究着重在其作为胞质 DNA感受器触发一系列通路方面的探索，但关于鸡cGAS在体外的蛋白质表达以及鸡cGAS在DNA病毒感染后细胞内定位、转位的研究较少。cGAS对胞质内DNA的识别是非特异性的，几乎可以识别所有的双链DNA [15-16] 。
本研究拟通过克隆chcGAS的完整开放阅读框序列，构建原核表达载体，获得chcGAS蛋白，此外，通过对比chcGAS被FAdV-4感染前后细胞定位的变化更进一步阐述chcGAS在触发天然免疫激活中的作用，以期为进一步研究FAdV-4与cGAS-STING信号通路的关联调控机制提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 细胞和毒株
鸡肝癌（LMH）细胞由中国农业科学院上海兽医研究所刘光清研究员赠送。FAdV-4 AH-F19株 [17]（登录号：MN781666）由本实验室分离并经过鉴定后保存于-80 ℃冰箱。
1.2 菌株和质粒
感受态细胞DH5α、Rosseta（DE3）购于南京擎科生物科技有限公司。pET-32a、pCAGGS-HA、pmCherry-C1质粒由本实验室保存于-20 ℃冰箱。
1.3 主要试剂
SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、ECL发光显色工作液、质粒小量提取试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司，2×Hiff Canace? Gold PCR Master Mix購自上海翌圣生物科技有限公司，去内毒素质粒提取试剂盒购自北京天漠科技开发有限公司，PAGE蛋白凝胶快速配制试剂盒、5×蛋白质上样缓冲液、雅酶三色预染Marker购自上海雅酶生物医药科技有限公司，EcoR I限制性内切酶购自宝日医生物技术（北京）有限公司。同源重组连接酶购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司，鼠抗HA单克隆抗体、鼠抗His单克隆抗体购自艾比玛特生物医药（上海）有限公司，FITC标记二抗羊抗鼠、山羊抗鼠IgG-HRP购自武汉博士德生物工程有限公司。
1.4 序列分析与结构域预测
从NCBI中下载已发表的一些物种的cGAS序列，通过Megalign软件进行同源性分析并利用MEGA5.0对各物种序列构建遗传进化树。用SMART在线网站（http：//smart.embl-heidelberg.de/）预测chcGAS的结构域。
1.5 引物设计与基因扩增
根据GenBank中发表的chcGAS基因序列，使用Primer Premier 5软件设计基因扩增的上下游引物，引物合成序列见表1。按照RNA提取试剂盒说明书提取LMH细胞中的总RNA并反转录为cDNA，以此为模板扩增chcGAS特异性引物。
1.6 重组质粒chcGAS载体的构建
根据chcGAS基因序列，利用CE DesignV1.04软件依次设计pET-32a-chcGAS、pCAGGS-HA-chcGAS、pmCherry-C1-chcGAS同源臂引物，引物合成序列见表1。
PCR反应体系（50 μl）：2×Hiff Canace?Gold PCR Master Mix 25 μl、ddH2O 19 μl、 DNA模板2 μl、上下游引物各2 μl 。PCR反应条件：98 ℃预变性3 min；
98 ℃变性10 s，58 ℃ 退火20 s，72 ℃延伸3 min，共35个循环；
72 ℃再延伸5 min。利用PCR扩增含有酶切位点的chcGAS基因，PCR产物分别切胶回收，将其克隆到经EcoR I酶切的pET-32a、pCAGGS-HA、pmCherry-C1空载体中。重组质粒经PCR鉴定正确后移交到测序公司进行测序。重组质粒经鉴定后分别命名为pET-32a-chcGAS、pCAGGS-HA-chcGAS、pmCherry-C1-chcGAS。
1.7 pET-32a-chcGAS诱导表达与可溶性分析
将pET-32a-chcGAS与pET-32a空载体质粒分别转化Rosetta（DE3）感受态细胞，涂布到氨苄抗性的固体培养板，次日分别挑取单菌落至溶菌肉汤（LB）液体培养基中。用摇床37 ℃、180 r/min摇4～5 h后转接到大容积的LB液体培养基中，再次用摇床37 ℃、180 r/min培养，当OD600值为0.6～0.8时，添加0.5 mmol/L的异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）于15 ℃、120 r/min诱导表达，取诱导20 h后的菌体，用磷酸盐缓冲液（PBS）进行洗菌，随后超声裂解至液体清亮，离心后分别吸取上清液和沉淀进行SDS-PAGE电泳，而后经考马斯亮蓝染色、脱色后进行观察和分析。通过分析确定重组蛋白质表达可溶性。
1.8 Western-blot检测
将诱导后处理好的蛋白质样品，在 SDS-PAGE凝胶电泳后转至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，恒流100 mA转膜1.0 h。将转膜后的PVDF膜放入配制好的5%脱脂奶粉封闭液中，随后移入4 ℃冰箱过夜封闭，用磷酸缓冲液（PBST）洗涤2～3次，按照1∶5 000（体积比）加入鼠抗His单克隆抗体作为一抗，常温下孵育1.5 h，在用PBST洗涤2～3次，同样按照1∶5 000（体积比）加入山羊抗鼠lgG-HRP作为二抗，常温孵育1.0 h，用PBST洗涤2～3次，随后用辣根过氧化物酶化学发光剂（HRP-ECL）底物发光显色工作液进行显色。
1.9 chcGAS感染前后亚细胞定位
为了观察chcGAS在FAdV-4感染前后亚细胞定位变化，设置2组试验，分为感染组和对照组（未感染），分别将2组长满的LMH细胞接种于铺上细胞爬片的12孔板中，观察细胞，细胞密度达到80%左右将pCAGGS-HA-chcGAS重组质粒转染进细胞，对照组24 h后弃培养液，换成新鲜的维持培养液，感染组在质粒转染24 h后接种FAdV-4 AH-F19株，37 ℃培养1 h，弃去培养液，用PBS清洗细胞2次，感染8 h后分别收取感染组和对照组样品，通过间接免疫荧光步骤，分别使用HA标签鼠抗多克隆抗体作为一抗，FITC绿色荧光抗体作为二抗，而后利用激光共聚焦观察分析chcGAS在LMH细胞中的定位情况。
为了进一步证实chcGAS的定位，同样将pmCherry-C1-chcGAS重组质粒转染到LMH细胞，以相同的方法对转染后的细胞进行收样，利用pmCherry-C1载体自带红色荧光在激光共聚焦显微镜下观察chcGAS定位情况，观察是否与pCAGGS-HA-chcGAS重组质粒定位情况一致。
2 结果与分析
2.1 序列分析与结构域预测
通过Megalign比对分析物种间cGAS核苷酸同源性，结果显示，chcGAS与其他物种cGAS的同源性为50.5%～84.4%（图1）。将chcGAS与其他物种cGAS核苷酸序列比对并对系统发育树进行分析，结果显示，chcGAS与鸭子cGAS位于同一分支上，亲缘关系较近；
但与鱼类cGAS和哺乳类cGAS不在同一分支上，表明亲缘关系稍远（图2）。利用SMART在线网站预测chcGAS的结构域，结果显示，编码区包括2个低复杂区域（Low-Complexity region， LCR），分别为第3至第39氨基酸与第68至第81氨基酸，还包括1个高度保守的 Mab-21结构域 （第129至第429氨基酸）（图3）。
2.2 chcGAS基因扩增结果
经PCR扩增chcGAS基因得到目的条带（图4），目的片段大小为约1 317 bp，显示与预期条带大小一致，经测序比对后与目的基因序列完全一致。
2.3 重组质粒的酶切鉴定
将pET-32a-chcGAS、pCAGGS-HA-chcGAS、pmCherry-C1-chcGAS重组质粒经EcoR I酶切鉴定后在核酸凝胶电泳上显示的条带大小与预期的载体大小和目的基因大小一致（图5），并且经测序比对分析后与目的基因序列完全一致，碱基未见缺失或者突变，说明重组质粒构建成功。
2.4 pET-32a-chcGAS表达产物的SDS-PAGE分析
将pET-32a-chcGAS重組质粒转化到Rosetta（DE3）感受态细胞中后，成功表达出相对分子质量为75 000的目的蛋白质（图6），分析结果显示，蛋白质在包涵体和上清液都有表达且主要集中在上清液表达。
2.5 重组蛋白质的Western-blot鉴定
利用Western-blot对蛋白质进一步鉴定分析，结果（图7）显示，在PVDF膜上有一条明显条带且位置大小与预期目的蛋白质大小一致。说明重组蛋白质可以被抗His标签的一抗识别。
2.6 chcGAS感染前后亚细胞定位分析
通过在LMH细胞中转染pCAGGS-HA-chcGAS和pmCherry-Cl-chcGAS来研究chcGAS的细胞定位。结果显示，未感染FAdV-4时chcGAS主要分布在细胞核的核膜上，感染FAdV-4后，可以观察到chcGAS从细胞核的核膜向细胞质里转移（图8、图9）。
3 讨论
cGAS作为近几年来发现的一种新型胞质DNA受体，其功能为识别胞质内的DNA。然而鸡cGAS基因的相关研究较少，通过Megalign比对分析物种间cGAS核苷酸同源性，结果显示，chcGAS与其他物种cGAS的同源性为50.5%～84.4%，且具有2个在第3至第39氨基酸和第68至第81氨基酸的低复杂区域和1个高度保守的具有第129至第429氨基酸的Mab-21结构域，表明chcGAS与其他物种具有差异。本研究对chcGAS基因进行了克隆。首先，通过构建pET-32a-chcGAS原核表达载体，其次，经过多种对比分析后从大肠杆菌表达菌株中挑选了Rosetta（DE3）表達菌株，最后以15 ℃、异丙基硫代半乳糖苷（IPTG） 0.5 mmol/L、诱导20 h为最适诱导条件，成功表达了chcGAS蛋白。SDS-PAGE分析结果显示，重组蛋白质chcGAS主要以可溶性蛋白质的形式在上清液处表达，利用His标签抗体经Western-blot鉴定，在PVDF膜上显示有单一的条带且与预期目的蛋白质条带大小相符。
在正常情况下DNA只存在于细胞核和线粒体中，但在病毒感染后会游离在细胞质中，随后被位于细胞质中的cGAS识别，继而激活cGAS-STING通路发挥抗病毒作用[10]。目前为止报道人和小鼠cGAS调控较多[18]，以往的研究中，普遍认为人cGAS仅仅分布在细胞质中[19]，并行使DNA识别受体的功能[20-21]。但近期有试验结果表明，人cGAS定位在细胞膜上，并指出有外源DNA感染细胞时cGAS发生移位即可从细胞膜上转移到细胞质中从而识别一些DNA而后激活天然免疫。鸡cGAS还没有得到足够的研究，尤其鸡cGAS的细胞定位、功能及精确调控机制还未完全研究清楚。先前Wang等[14]通过在鸡胚成纤维细胞中瞬时转染Flag标记的cGAS来研究鸡cGAS的亚细胞定位，定位分析结果表明，chcGAS分布在细胞质中。本研究使用pCAGGS-HA-chcGAS和pmCherry-C1-chcGAS 2个重组质粒在LMH细胞中对chcGAS进行定位，结果显示，chcGAS是定位在细胞核的核膜上，此外还通过FAdV-4感染chcGAS对细胞定位进行观察，结果表明，在FAdV-4感染后chcGAS定位可从细胞核的核膜上转移到细胞质中，后续将通过构建稳定表达chcGAS的LMH细胞系对这一结果进行更加深入地研究验证。通过chcGAS定位了解其在天然免疫中发挥的作用，同时也为后续研究chcGAS的功能提供了理论依据。
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（責任编辑：陈海霞）
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