马晏然,杨茜,李宏,宋京芝,周璇,项锋钢,
(青岛大学,山东 青岛 266071 1 基础医学院病理学系；
2 附属医院病理科)
肝细胞肝癌(HCC)是发展中国家最常见的原发性肝癌类型，主要由病毒感染引起[1]。在我国，其病死率仅次于胃癌[2]。根治性切除术是HCC的主要治疗方式，但HCC病人术后有较高的复发转移率，预后不理想[3-4]。表观遗传修饰的调节及不同信号转导通路的交叉作用导致HCC发生发展的机制极其复杂[5-7]。因此，探讨HCC发生发展的分子机制，寻找影响其发生、发展及判断其预后的分子标志物将具有重要意义。细胞周期蛋白A1(CyclinA1)参与细胞周期循环的调控，在维持细胞有序的增殖和分裂活动中起作用[8]。研究表明，CyclinA1在多种恶性肿瘤中异常表达，并提示预后不良[9-10]。但是CyclinA1影响HCC发生发展的研究相对较少。有研究显示，CyclinA1在HCC组织中异常表达，通过抑制细胞凋亡，有利于肿瘤形成[11]。本研究通过检测CyclinA1在HCC中的表达，探讨CyclinA1与HCC病人临床病理特征及预后的关系，为HCC的临床治疗提供新的靶点。
1.1 实验材料
1.1.1标本收集 收集青岛大学附属医院2014—2016年手术切除的HCC石蜡包埋标本284对，包括HCC及其相应癌旁非瘤组织(距肿瘤边缘>5 cm)，病人男244例，女40例；
年龄32～83岁，平均(57.4±9.7)岁；
病人临床病理资料均完整，术前均未接受放、化疗。HCC病人通过电话与住院复查结合的方式随访，随访截止日期为2021年7月31日，共有251例随访满5年且资料完整，分析其术后生存时间。选取2020年12月—2021年1月手术切除、立即冻存于液氮中的9对新鲜HCC及相应癌旁非瘤组织(距肿瘤边缘>5 cm)。本研究经青岛大学附属医院伦理委员会批准。
1.1.2主要试剂 CyclinA1鼠抗人单克隆抗体购自美国安迪科技公司，免疫组织化学工作浓度1∶100，Western blot工作浓度1∶1 000；
Trizol裂解液、RIPA裂解液、PV6000免疫组织化学检测试剂盒、BCA蛋白检测试剂盒、PAGE凝胶快速制备试剂盒、ECL发光液均购自北京索莱宝科技有限公司；
PrimeScriptTM逆转录试剂盒购自大连宝生物工程有限公司；
SYBR PremixEx TaqTMⅡ荧光定量试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法检测CyclinA1 mRNA的表达 应用TRizol裂解液提取新鲜组织标本总RNA，应用PrimeScriptTM试剂盒反转录，按试剂盒说明书操作。qRT-PCR反应条件[12]：95 ℃预变性30 s；
95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共进行40个循环。HCC及相应癌旁非瘤组织中CyclinA1 mRNA的相对表达量计算使用2- △△Ct方法[12]。以GAPDHmRNA表达量作为标准化内参。PCR引物及其序列见表1。
表1 PCR引物及其序列
1.2.2Western blot方法检测CyclinA1蛋白的表达 应用RIPA裂解液提取新鲜HCC及相应癌旁非瘤组织总蛋白。按BCA检测试剂盒说明书操作，检测蛋白浓度。配制体积分数为0.10的PAGE凝胶，每孔加入30 μg蛋白；
80 V电泳，300 mA电转，各持续1.5 h，快速封闭液封闭10 min，TBST洗膜3次；
室温孵育目标一抗2 h，TBST洗膜3次; 室温孵育二抗1.5 h；
TBST洗膜3次后，使用ECL发光液在暗室中显影。条带灰度值经Image J软件分析后，计算蛋白表达量。
1.2.3组织芯片的制作 石蜡包埋组织切片，苏木精-伊红(HE)染色，由两位经验丰富的病理医师显微镜下观察，标记肿瘤及癌旁非瘤组织的典型区域。应用全自动组织芯片点样仪MiniCore3制作孔径1.5 mm的组织芯片，4 μm切片后复检，用于免疫组织化学染色。
1.2.4免疫组织化学染色方法检测CyclinA1的表达 采用PV 6000法进行免疫组织化学染色：组织切片经二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化后，浸泡于体积分数0.03的H2O2灭活内源性酶；
水洗后，微波加热修复(EDTA，pH值8)，自然冷却，PBS冲洗3次，滴加一抗，37 ℃孵育2 h；
PBS冲洗3次，滴加二抗，37 ℃孵育30 min；
PBS冲洗3次，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片，显微镜下观察[12]。以PBS代替一抗作为阴性对照，以已知阳性表达CyclinA1的结肠癌组织作为阳性对照。结果判定[13-14]：以细胞核染色呈棕黄色或棕褐色计为CyclinA1阳性表达。首先对阳性细胞染色强度评分：0分，无着色(-)；
1分，棕黄色(+)；
2分，棕褐色()。再对阳性细胞所占百分比评分：< 10%为0分，10%～50%为1分，≥50%为2分。两者得分相加，≤ 2分为低表达，> 2分为高表达。
1.3 统计学处理
2.1 HCC及其癌旁非瘤组织中CyclinA1 mRNA和蛋白表达比较
本研究9对新鲜HCC及相应癌旁非瘤组织中CyclinA1 mRNA的表达水平分别为-4.782±1.505和-6.714±1.502，差异具有统计学意义(t=4.739，P<0.01)；
CyclinA1蛋白表达水平分别为2.756±0.134和0.904±0.057，差异有统计学意义(t=12.690，P<0.01)。见图1。
T:HCC组织；
N：相应癌旁非瘤组织。图1 HCC及相应癌旁非瘤组织中CyclinA1表达的Western blot检测
2.2 HCC及相应癌旁非瘤组织中CyclinA1表达比较
IHC染色显示，CyclinA1主要在细胞核中阳性表达(图2)。HCC组织中CyclinA1高表达146例(51.41%)，而相应癌旁非瘤组织中无高表达，两组比较差异有统计学意义(z=-16.019，P<0.01)。
A:CyclinA1在HCC组织中呈高表达；
B：CyclinA1在癌旁非瘤石蜡包埋组织中呈低表达；
C：CyclinA1在癌旁非瘤石蜡包埋组织中呈阴性表达。IHC染色，400倍。图2 CyclinA1在组织芯片中的表达
2.3 CyclinA1表达与HCC病人临床病理特征的关系
CyclinA1的表达与HCC病人肿瘤的分化程度、TNM分期、肿瘤是否多发、脉管侵犯、被膜侵犯和肿瘤大小均有关(χ2=4.559～15.551，P<0.05)，而与病人性别、年龄、合并肝硬化、携带乙型肝炎表面抗原、甲胎蛋白无关(χ2=0.008～2.255，P>0.05)。见表2。
表2 CyclinA1表达与HCC病人临床病理特征的关系(例(χ/%))
2.4 CyclinA1表达与HCC病人术后生存期关系
Kaplan-Meier分析表明，CyclinA1低表达病人的平均总生存时间(OS)和无病生存时间(DFS)分别为53.7个月和51.7个月，而高表达病人分别为45.9个月和43.2个月，差异有显著性(χ2=15.060、12.930，P<0.05)。CyclinA1阳性表达的HCC病人中，CyclinA1低表达者的平均OS和DFS分别为59.4个月和59.2个月，而高表达者分别为45.7个月和42.3个月，差异有显著性(χ2=23.150、20.610，P<0.001)。分化程度差的病人中，CyclinA1低表达病人的平均OS和DFS分别为50.1个月和46.8个月，而高表达病人分别为38.4个月和35.3个月，差异有显著性(χ2=6.921、5.116，P<0.05)。肿瘤多发的HCC病人中，CyclinA1低表达者的平均OS和DFS分别为46.1个月和41.9个月，而高表达者分别为27.8个月和22.6个月，差异有显著性(χ2=7.875、6.876，P<0.01)。脉管侵犯的HCC病人中，CyclinA1低表达者的平均OS和DFS分为51.1个月和48.2个月，而高表达者分别为38.4个月和35.4个月，差异有显著性(χ2=10.970、8.904，P<0.01)。被膜侵犯的HCC病人中，CyclinA1低表达病人的平均OS和DFS分别为52.7个月和49.6个月，而高表达的病人分别为41.3个月和38.0个月，差异有显著性(χ2=11.420、8.233，P<0.01)。肿瘤直径≥5 cm的HCC病人中，CyclinA1低表达者的平均OS和DFS分别为50.1个月和47.6个月，而高表达的病人分别为39.5个月和35.3个月，差异有显著性(χ2=4.991、4.203，P<0.05)。见图3、4。
A、B：CyclinA1表达与HCC病人OS及DFS的关系；
C、D：CyclinA1阳性表达HCC病人表达水平与OS及DFS的关系；
E、F：分化程度差的HCC病人CyclinA1的表达与OS及DFS的关系；
G、H：肿瘤多发的HCC病人CyclinA1表达与OS及DFS的关系；
I、J：有脉管侵犯的HCC病人CyclinA1表达与OS及DFS的关系；
K、L：有被膜侵犯的HCC病人CyclinA1表达与OS及DFS的关系。图3 CyclinA1表达与HCC病人术后生存期的Kaplan-Meier分析
图4 肿瘤≥5 cm的HCC病人CyclinA1表达与OS及DFS的关系
2.5 Cox回归模型分析影响HCC病人的术后生存时间的因素
单因素分析显示，CyclinA1的表达水平(β=1.062，HR(95%CI)=2.892(1.569～5.339)，P<0.001)以及分化程度、TNM分期、肿瘤是否多发、脉管侵犯、肿瘤大小、甲胎蛋白均是影响病人术后OS的因素(β=-1.132～-0.511，HR(95%CI)=0.322(0.194～0.536)～0.600(0.352～1.022)，P<0.05)；
CyclinA1的表达水平(β=0.986，HR(95%CI)=2.682(1.455～4.944)，P<0.001)及分化程度、TNM分期、肿瘤是否多发、脉管侵犯、被膜侵犯、肿瘤大小、甲胎蛋白(β=-1.144～-0.563，HR(95%CI)=0.318(0.191～0.530)～0.569(0.334～0.970)，P<0.05)是术后DFS的影响因素。将单因素分析中具有统计学意义的临床病理参数进行多因素分析，结果显示，CyclinA1表达、分化程度、肿瘤是否多发、肿瘤大小既是影响术后OS的独立预后因素(β=-1.227～1.397，HR(95%CI)=0.293(0.171～0.503)～3.706(2.045～6.717)，P<0.05)，也是影响术后DFS的独立预后因素(β=-1.379～1.453，HR(95%CI)=0.252(0.145～0.436)～4.274(2.188～8.350)，P<0.05)。见表3～4。
表3 影响HCC病人OS的单因素及多因素Cox回归模型分析
表4 影响HCC病人DFS的单因素及多因素Cox回归模型分析
CyclinA1的编码基因位于染色体13q12.3-13上,蛋白质主要定位在细胞核内[15]。在细胞周期循环中,CyclinA1蛋白与细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶2(CDK2)形成复合物，促进G1/S转换、启动DNA合成[16-17]。此外，CyclinA1可以与视网膜母细胞瘤蛋白(pRb)和p21蛋白结合形成活性复合物，调节多种促生长基因的表达[8,15,18]。
研究表明，在多种恶性肿瘤包括前列腺癌、食管癌、精原细胞癌、乳癌等组织中，CyclinA1的表达升高[9-10,19-24]。然而，CyclinA1在HCC中表达研究少见报道，CHEN等[11]研究发现，HCC组织中的CyclinA1表达明显高于相应癌旁非瘤组织。本文检测HCC石蜡配对组织和新鲜HCC组织CyclinA1 mRNA和蛋白表达，结果显示肿瘤组织中CyclinA1 mRNA和蛋白表达水平明显升高，表明CyclinA1可能参与HCC的发生过程。
近年来的研究表明，CyclinA1的表达与肿瘤大小相关，且肿瘤高Ki-67指数组中CyclinA1的表达水平高于低Ki67指数组[25]。YANG等[26]研究发现，在人肺成纤维细胞中，突变型P53蛋白通过下调CyclinA1抑制因子p21表达，导致CyclinA1的表达升高，细胞增殖能力增强。提示CyclinA1可增强肿瘤细胞增殖活性。有研究认为，CyclinA1在恶性肿瘤增殖中发挥了重要作用[21]。本文研究结果显示，除肿瘤大小外，与HCC组织中CyclinA1表达有关的还有肿瘤分化程度、TNM分期、脉管侵犯、被膜侵犯和肿瘤是否多发，肿瘤分化程度差、TNM分期晚、有脉管侵犯、被膜侵犯及增殖能力强的病人CyclinA1的表达水平更高，说明CyclinA1高表达可增强HCC的增殖活性，且更利于HCC浸润转移,CyclinA1可能与HCC的发展密切相关。有研究表明，在pRb的参与下，CyclinA1通过直接绑定基质金属蛋白酶2(MMP2)和血管内皮生长因子(VEGF)的启动子区域，增加MMP2蛋白的转录，促进VEGF分泌，使癌细胞更易发生浸润、转移[20]。这可能是CyclinA1促进HCC细胞侵袭转移的原因之一。然而，目前关于CyclinA1影响HCC侵袭转移的具体分子机制仍不明确，有待今后的研究进一步探讨。
此外，CyclinA1的表达与多种肿瘤病人的预后关系密切，CyclinA1高表达肿瘤病人的术后OS及DFS较低表达者更短，CyclinA1的表达水平是影响肿瘤病人术后OS及DFS的独立预后因素[24]。本研究结果表明，高表达CyclinA1的HCC病人术后OS及DFS较低表达者更短；
在CyclinA1阳性表达、被膜侵犯、脉管侵犯、肿瘤多发、分化程度差和肿瘤直径≥5 cm的HCC病人中，CyclinA1高表达组的术后OS及DFS均较低表达组更短。有研究显示，CyclinA1的表达水平与肿瘤细胞化疗药物耐药性呈正相关，CyclinA1过表达显著降低化疗药物诱导的肿瘤细胞凋亡。这或许是导致HCC病人术后预后较差的诸多原因之一。本文Cox回归模型分析显示，CyclinA1表达及肿瘤多发性、分化程度、肿瘤大小是影响HCC病人术后OS及DFS的独立预后因素；
CyclinA1高表达与病人预后不良有关，提示CyclinA1可能作为一种常规检测指标用于评估HCC病人术后生存期。
本研究存在一定的局限性：284例HCC病人术后生存时间满5年251例，应完善随访资料并分析，以进一步证实上述实验结果；
未使用细胞实验以及裸鼠实验等探究CyclinA1在HCC发生发展中确切分子机制；
此外，虽有研究证明CyclinA1影响HCC细胞凋亡，但相应的调控机制仍不明确，这都是值得未来深入探讨及研究的方向。
综上所述，CyclinA1可能参与了HCC发生发展的过程，CyclinA1高表达的病人术后预后不良，CyclinA1表达对HCC病人预后的判断具有较大指导意义。今后的研究中，可采用细胞学实验与动物实验深入探讨CyclinA1影响HCC发生发展的确切分子作用机制，以指导临床药物分子靶向治疗、病人预后的判断。
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