柴仲秋 周 冰 张静莎 韩云雨
(1 天津市滨海新区中医医院,天津,300451; 2 天津中医药大学,天津,301608)
近年来，中医辨证论治在结直肠癌(Colorectal Cancer，CRC)治疗方案中逐渐成为不可忽视的一环，其积极作用也日益显现。然而由于缺乏客观、稳定的诊断及疗效评价指标，中医证候的辨识多显得模糊不稳定。因此，探寻中医证候标志性因子，为中医证候客观化提供依据一直以来是研究的热点和方向。课题组在前期对临床CRC患者进行辨证分析，发现血瘀证为临床常见证候之一，因此应用iTRAQ定量蛋白质组学对血瘀证肿瘤组织和正常组织的差异表达蛋白进行了比较和分析。
1.1 资料与材料 选取2012年8月至2019年8月因CRC就诊于天津市滨海新区中医医院行手术治疗的患者158例进行临床资料采集和中医证候调查。本研究通过伦理委员会审批(伦理审批号：201201012)。手术切除肿瘤后每例标本分别取癌灶肠管组织及远端正常肠管组织(距肿瘤边缘5～8 cm，具体根据截取肠管长度，选择最远端正常组织)，各2份，立即置于液氮冻存。
1.2 诊断标准 参照中华中医药学会《中医肛肠科常见病诊疗指南》[1]、Dukes分期及AJCC/UICC TNM分期标准进行病情分期判定[2]。
1.3 纳入标准 1)CRC初发患者;2)年龄<85岁的患者;3)已签署知情同意书者。
1.4 排除标准 1)入组前已经接受放化疗患者;2)伴有急性阑尾炎、腹膜炎等其他急腹症症状的患者;3)合并严重的心、肝、肾、脑等脏器器质性或功能性疾病患者;4)意识或言语表述不清的患者;5)无法判断中医证型及资料不全患者。
1.5 试剂与仪器 iTRAQ®试剂盒中的还原剂(AB Sciex公司，美国，货号：4381664)、iTRAQ®试剂盒中的Cysteine-Blocking试剂(AB Sciex公司，美国，货号：4381664)、iTRAQ®试剂盒中的解散缓冲试剂(AB Sciex公司，美国，货号：4381664)、胰蛋白酶(AB Sciex公司，美国，货号：4370285，4352157)，溶于解散缓冲试剂；
高效液相色谱仪：[Thermo Scientic公司，美国，型号：EASY-nLC 1000 System(Nano HPLC)]、质谱系统(Thermo Scientic公司，美国，型号：Q-Exactive)。
1.6 证候调查方法 结合中医专家临床经验制订《结直肠癌中医证候调查初表》，并请2名中医主任医师对该表进行审核及修正。由2名主治医师依照中医证候采集表对158例患者进行一般情况及中医四诊信息的调查。采取双人核对录入的方法将数据录入Epidata 3.0流行病学软件建立数据库。对接受择期手术的患者进行详细的术式及病理信息采集。
1.7 蛋白提取 将样本用液氮预冷的砸碎器砸碎，液氮研磨，按照1∶10(W/V)加入裂解液{7 mmol/L尿素，2 mmol/L硫脲，4% 3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate,CHAPS)}，涡旋混匀，室温提取30 min；
40 000×g，10 ℃离心1 h，小心取出上清，分装后冻存于-80 ℃。同时进行分组标记。二喹啉甲酸法(Bicinchoninic Acid，BCA)法定量检测蛋白质水平。
1.8 蛋白酶解及标记 蛋白定量后取200 μg蛋白溶液置于离心管中，按照iTRAQ试剂盒操作说明得到100 μL酶解后的样品，并分别进行标记，肿瘤组织标记为117，正常组织标记为118。
1.9 酶解肽段离线预分离及液质色谱-串联质谱法(Liquid Chromatography-mass Spectroscopy/Mass Spectrometry，LC-MS/MS质谱分析
1.9.1 高pH条件下的反相色谱分离 用100 μL的流动相A溶解混合标记后的样品，使用400 μg酶解好的牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)进行分离，取100 μL准备好的样本上样，流速0.7 mL/min分离。取100 μL准备好的样本上样；
流速0.7 mL/min梯度分离。
1.9.2 纳升级反相色谱-Q-Exactive进行蛋白质分析 将高pH反相分离得到的组分用20 μL 12%ACN，0.1%FA复溶;12 000 r/min离心10 min，离心半径15 cm，吸取上清上样;上样体积8 μL，采取夹心法上样;Loading Pump流速3 μL/min，5 min;分离流速0.3 μL/min。设置质谱参数后，进行质朴分析。
1.9.3 质谱数据分析 在本次实验中选择的数据库来自美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)，数据库本版为Ref_Human_130704。iTRAQ的质谱分析是由Thermo Q-Exactive型质谱完成，产生的质谱原始文件采用Thermo公司的配套商用软件Proteome Discoverer1.3处理。
1.9.4 数据的生物信息解析 将组间的差异表达蛋白输入Uniprot数据库进行功能和基因检索，将对应基因保存为TXT文件，输入到Metascape，选择选择H.Sapiens，然后选择Express Analysis，可自动生成对差异表达蛋白进行的通路富集和分析。
2.1 证候调查结果 证候诊断为血瘀证的患者共24例，男13例，女11例，平均年龄为(58.43±16.05)岁；
TNM分期：Ⅰ期15例、Ⅱ期6例、Ⅲ期3例；
病理大体分型：隆起型6例、溃疡型13例、浸润型5例；
病理类型：腺癌19例、黏液腺癌2例、印戒细胞癌2例、腺癌并印戒细胞癌1例。
2.2 差异表达蛋白识别 根据蛋白定量信息，选取上下调差异倍数≥1.4的蛋白作为差异蛋白结果。在血瘀证组织比较中，肿瘤组织较远端正常组织差异蛋白共55个，其中上调13个。见表1。下调42个。见表2。
表1 血瘀证肿瘤组织与正常组织比较
表2 血瘀证肿瘤组织与正常组织比较
续表2 血瘀证肿瘤组织与正常组织比较
2.3 差异表达蛋白分析 应用Metascape对差异表达蛋白进行通路富集显示，差异表达蛋白多集中在红细胞吸收氧气并释放二氧化碳、超分子纤维组织、表皮细胞分化、核心组织、NABA核心母体、对无机物的反应、Nop56p相关前rRNA复合体、中性粒细胞迁移、DNA结合的调控、水解酶活性负调节、脂肪酸衍生物代谢过程、上皮细胞增殖的正调控和生物氧化等通路。见表3、图1。基因本体(Gene Ontology,GO)分析主要生物过程集中红细胞吸收氧气并释放二氧化碳、角化、核心组织、超分子纤维组织、血压调节和整合素途径。见图2。
表3 差异表达蛋白的通路富集
图1 差异表达蛋白通路富集
图2 GO富集分析主要生物过程
CRC是胃肠道中常见的恶性肿瘤，在我国以41～65岁人群发病率较高。近20年来，尤其在城市中，发病率明显上升[4]。CRC的发病发展是多步骤、多阶段及多基因参与的过程[5]。以往关于CRC的研究大多是基于其临床病理数据(例如肿瘤大小、肿瘤数量、淋巴结及血管浸润等)和单分子生物标志物[例如癌胚抗原(Carcinoembryonic Antigen，CEA)及糖类抗原199(Carbohydrate Antigen199，CA199)、CA125等]所作的预测[6-8]。随着研究的不断进展，研究者认为基于蛋白水平的研究相较于RNA水平更有利于在临床上应用[9]。
考虑到影像学在CRC分期中的影响[10-12]，课题组均以术后标本病理结果进行临床分期作为纳入标准的依据。在通过比较血瘀证肿瘤组织和正常组织的差异表达蛋白发现，差异表达蛋白主要集中在红细胞吸收氧气并释放二氧化碳、超分子纤维组织、表皮细胞分化、核心组织、NABA核心母体、对无机物的反应、Nop56p相关前rRNA复合体、中性粒细胞迁移、DNA结合的调控、水解酶活性负调节、脂肪酸衍生物代谢过程、上皮细胞增殖的正调控和生物氧化等过程中。
既往有研究发现在大肠癌发生、侵袭、转移过程中，某些病理因素导致机体循环障碍而发生组织缺氧，使血管活性因子之间的动态平衡发生改变，表现出不同程度的外周微循环障碍[13]，血瘀证CRC患者的组织存在明显缺氧症状，“血管生成开关”动态平衡发生改变，引发血管的高阻力状态，进而发生大肠癌血管新生的病理变化，并进一步研究证明活血化瘀中药可能是通过调节缺氧微环境来抑制大肠癌血管新生，也为缺氧致血瘀提供了有力的科学依据[14]。这与本研究发现的血瘀证肿瘤组织和正常组织的差异表达蛋白集中在红细胞吸收氧气并释放二氧化碳的生物过程中的结果有相同之处。
CRC血瘀证肿瘤组织与正常组织的差异表达蛋白的研究，为研究中医证候本质提供了一些新的方向，但仍有其技术的局限性。在中医证候本质的研究中，除蛋白组学外，研究者还尝试应用多数据库分析[15-16]、代谢组学[17-19]、网络生物学[20]、系统生物学[21-22]、表观遗传学[23-24]以及基因多态性[25]等方法来尝试相关研究，为该领域研究方法的探讨提供了更多的研究方案和思考。
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