袁仲瑾 ，岑剑伟, ，李来好，杨贤庆，黄 卉，魏 涯，郝淑贤，赵永强，王悦齐，林 织
1. 上海海洋大学 食品学院，上海 201306
2. 中国水产科学研究院南海水产研究所/农业农村部水产品加工重点实验室，广东 广州 510300
3. 大连工业大学/海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心，辽宁 大连 116034
4. 广东顺欣海洋渔业集团有限公司，广东 阳江 529800
珍珠龙胆石斑鱼 (Epinephelus fuscoguttatus ♀×E. lanceolatus ♂) 是名贵的暖水性经济海水鱼类，在商品鱼市场主要以鲜销为主，具有较高的经济效益[1]。石斑鱼背鳍发达，在运输环节易对操作者和鱼体造成损伤，且在鱼体捕捞起塘后如无适合的暂养条件容易使鱼体产生剧烈的应激反应，使其组织和器官产生应答机制，引发生理功能紊乱，导致鱼体病原感染、组织受损甚至死亡[2]，造成巨大的经济损失。应激反应还会增加鱼体氨类代谢物质的排放量，加速氨氮等有毒物质在水中的富集，使鱼类成活率进一步降低。因此，研究珍珠龙胆石斑鱼在保活流通中的关键技术对于提高其经济效益具有重要意义。
低温保活是在水生生物所适温度范围内尽可能地将温度控制在最低水平，降低水生生物对外界刺激的应激反应强度，从而延长保活时间。低温保活技术已在大菱鲆 (Scophthalmus maximus)、大口黑鲈 (Micropterus salmoides)、彭泽鲫 (Carassius auratus) 及凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 等水产品中进行了广泛的研究与应用[3-6]。然而，不同种类的鱼对低温的敏感性不同，过低的温度会引发机体内部组织器官的氧化损伤，从而降低鱼体的生存能力[7]。暖水性鱼类比温水性鱼类对低温的耐受性低，攀鲈 (Anabas testudineus) 的死亡低温范围为 9.4～13.5 ℃[8]，小黄鱼 (Larimichthys polyactis) 的起始致死温度为6 ℃[9]，点篮子鱼 (Siganus guttatus) 的死亡临界温度为11.69～15.39 ℃[10]。本研究通过分析珍珠龙胆石斑鱼在不同暂养温度下的行为特征、成活率、物质代谢、非特异性免疫和抗氧化能力的变化，探讨其合适的长时暂养温度，为珍珠龙胆石斑鱼的保活流通提供理论依据。
1.1 试验材料
鲜活的珍珠龙胆石斑鱼 [体质量 (550±43) g] 购于广州融渔科技有限公司，养殖水温23～25 ℃。将购回的石斑鱼置于暂养池中，暂养6 h以消除短途运输造成的应激反应，之后用于试验。暂养条件：鱼、水质量比为1∶20，水温23～24 ℃，盐度25‰～26‰，暂养期间使用水循环系统循环过滤海水，空气泵24 h供氧，保证水体溶解氧质量浓度>7 mg·L−1。
1.2 主要试剂和仪器
1 000 μg·mL−1氨氮标准溶液 (GSB 04-2832-2011，国家有色金属及电子材料分析测试中心)；
水质氨氮环境标准样品 (批号：2005120、2005122，环境保护部标准样品研究所)；
浓盐酸 (优级纯，广州化学试剂厂)；
浓硫酸、无水乙醇 (分析纯，广州化学试剂厂)；
溴酸钾、溴化钾以及氢氧化钠 (分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；
溶菌酶 (LZM)、补体蛋白3 (C3) 检测试剂盒 (上海酶联生物科技有限公司)；
Bradford蛋白浓度测定试剂盒 (上海碧云天生物科技有限公司)；
超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GPx) 及丙二醛 (MDA) 测定试剂盒 (南京建成科技有限公司)。
Multi 3630 IDS便携式多参数测量仪 (德国WTW公司)；
AJ-300气相分子吸收光谱仪 (上海安杰环保科技股份有限公司)；
BS-800M全自动生化分析仪 (深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；
UV2550紫外可见分光光度计 (日本岛津公司)；
Bio-Tek全自动酶标仪 (上海Bio-Tek公司)；
高速台式冷冻离心机 (湖南湘仪实验仪器开发有限公司)；
SPX型智能生化培养箱 (宁波江南仪器厂)；
KD-2AS风冷式冷水机 (广州市澳鑫设备科技有限公司)。
1.3 试验方法
1.3.1 行为学试验
使用循环冷水机以0.5～1.0 ℃·h−1的速率缓慢降低珍珠龙胆石斑鱼的暂养水体温度，观察单位时间内鳃盖张合的次数，以其作为鱼的呼吸频率，记录不同温度下每尾石斑鱼的行为特征和呼吸频率。每次试验6尾鱼，试验重复3次，共观察18尾鱼。
1.3.2 保活处理
珍珠龙胆石斑鱼使用循环冷水机以0.5～1.0 ℃·h−1的速率分别缓慢降温至 14、16、18、20、24 ℃进行禁食暂养试验，期间鱼、水质量比为1∶10。每个温度组3个平行，每个平行6尾鱼。每6 h观察一次鱼体的状态，以鱼体转移至常温状态5 min内对外界刺激仍无反应视为死亡，记录不同温度下鱼体的存活时间。
珍珠龙胆石斑鱼使用循环冷水机以0.5～1.0℃·h−1的速率分别缓慢降温至 16、18、20、24 ℃后禁食暂养48 h，以在23～24 ℃暂养池中暂养6 h后的新鲜鱼体为对照组，各温度组和对照组均设3个平行，每个平行3尾鱼。取各组中鱼体的血液和肝脏作为样品用于后续指标的检测。
1.3.3 水质指标测定
试验组保活0、24、48、72 h后各取100 mL水样于100 mL聚乙烯瓶中。使用多参数水质分析仪测定水样电导率和pH。
水体中总氨氮测定参考金慧等[11]的方法。水样采集后加硫酸调节pH为1～3，加盖密封后摇匀，移取45 mL摇匀的样品至50 mL样品管中，将样品管置于气相分子吸收光谱仪自动进样器的进样盘上，进行样品的测定。仪器参数设定为：氘灯电流50.00 mA；
测定波长213.90 nm；
载气流量0.197 L·min−1；
载气为空气；
加热系统 87.5 ℃；
制冷系统 1.8 ℃；
样品泵速 80 r·min−1；
试剂泵速45 r·min−1；
氧化泵速 35 r·min−1。
1.3.4 非特异性免疫指标测定
将鱼体从保活箱中捞出经二氧化碳麻醉后 [水体通入二氧化碳达到饱和浓度，鱼体处于A4麻醉期 (沉在底部，尾部停止摆动，鳃盖张合停止时)][12]，使用1 mL一次性医用注射器从尾部静脉取血注入无抗凝剂的采血管中，血样在37 ℃生化培养箱中放置 2 h，4 ℃ 冰箱放置过夜后，4 ℃、3 000 r·min−1离心20 min制备血清，血清分装后移入−80 ℃保存备用。每尾鱼取500 μL血清使用全自动生化分析仪测定谷丙转氨酶 (ALT)、谷草转氨酶 (AST)、碱性磷酸酶 (AKP)、肌酸激酶 (CK)、白蛋白(ALB)、球蛋白 (GLB) 和总蛋白 (TP)。其中，ALT、AST、AKP和CK活性的测定采用速率法，ALB的测定采用溴甲酚绿法，TP的测定采用双缩脲法，GLB质量浓度通过计算得到。血清中LZM活性、C3质量浓度的测定采用酶联免疫法进行。
1.3.5 抗氧化指标测定
每尾鱼收集 (2.0±0.1) g肝脏组织放入50 mL离心管中，添加9倍体积的0.86%生理盐水，在冰上对组织进行均质，匀浆以4 ℃、3 000 r·min−1离心15 min，收集上清液，保存于−80 ℃待分析。肝脏组织中SOD、CAT、GPx活性与MDA浓度均采用试剂盒进行测定。
1.3.6 数据处理
采用SPSS 19.0软件进行数据处理，结果以“平均值±标准差 (±SD)”表示，组间差异采用单因素方差 (One-way ANOVA) 结合邓肯检验法进行比较分析。用Origin 2021软件绘制相关图表。
2.1 降温过程中珍珠龙胆石斑鱼的行为特征
本研究采用的降温速率为0.5～1.0 ℃·h−1，鱼体呼吸频率及行为特征在降温过程中的变化见表1。随着温度的降低，石斑鱼的呼吸频率和反应灵敏度呈下降趋势。温度降至20 ℃时，石斑鱼鳃盖开合幅度明显减弱，呼吸频率下降至31～33 次·min−1；
温度降至16 ℃时，鱼体鳃盖开合幅度继续减弱，鱼体受到外界刺激 (如敲击缸体) 时鳍棘会竖立，但无游动等行为出现；
温度降至14 ℃时，部分鱼体失去平衡左右晃动，极少部分出现浮头行为，并且体表脱落物开始增多，水体浑浊程度加重；
继续降温至13 ℃时，鱼体失去平衡、侧翻于水底并伴随着躁动不安、争向水面活动等应激行为；
水温降至12 ℃时，鱼体因呼吸中断出现裂鳃现象，短时间内置于常温水体中5 min可恢复正常游动，若长时间处于此状态下会导致死亡。
表1 不同温度下珍珠龙胆石斑鱼的呼吸频率及行为特征Table 1 Respiratory frequency and behavioral characteristics of grouper at different temperatures
2.2 暂养温度对珍珠龙胆石斑鱼存活时间的影响
暂养过程中珍珠龙胆石斑鱼陆续死亡，其生存曲线见图1，石斑鱼的存活时间随着温度的增加呈现先上升后下降的趋势。14 ℃组鱼体的存活时间显著低于其他温度保活组，暂养18 h后的成活率仅为33.3%；
16、18、20和24 ℃暂养条件下鱼体的存活时间分别为109、91、83和63 h。相较于24 ℃组，低温 (16、18 ℃) 组的鱼体存活时间增加了28～46 h。
图1 不同温度与时间对珍珠龙胆石斑鱼成活率的影响Fig. 1 Effects of different temperatures and time on survival rate of grouper
2.3 暂养温度对珍珠龙胆石斑鱼非特异性免疫的影响
鱼类的非特异性免疫在其免疫系统中占据主导地位，受到外界刺激时，非特异性免疫中的免疫因子会发生改变以增强机体的抵抗力。因为石斑鱼在14 ℃暂养24 h以内全部死亡，所以鱼体血清非特异性免疫指标的测定不包括14 ℃组。
与新鲜对照组相比，16 ℃暂养48 h后ALT、AST、CK活性无显著变化 (P>0.05)。在暂养过程中，ALT、AST和CK活性均随温度的升高呈现逐渐上升趋势，16、18和20 ℃组间ALT活性差异不显著 (P>0.05)。与16 ℃组相比，24 ℃组ALT活性升高57.7%，AST活性升高323.73%，CK活性升高717.02% (图2-a、2-b)，原因可能是鱼体长时间处于氨氮胁迫和饥饿胁迫的状态，导致肝脏、心肌组织受损。16～20 ℃范围内，暂养前后AKP活性无显著变化 (P>0.05)，24 ℃暂养48 h后AKP活性显著升高 (P<0.05)，较16 ℃组增加了43.56%。低温 (16、18 ℃) 组的LZM活性和暂养前相比无显著差异 (P>0.05)，而20和24 ℃组中LZM活性显著升高 (P<0.05)，且在24 ℃时达到最高，较16 ℃升高了32.72% (图2-c、2-d)。
暂养过程中随着温度的升高，血清GLB和TP质量浓度呈下降趋势 (图2-e、2-f)。同新鲜对照组相比，18、20 ℃组中GLB和TP质量浓度无显著变化 (P>0.05)，16 ℃组中GLB和TP质量浓度显著上升 (P<0.05)，24 ℃组中GLB和TP质量浓度显著降低 (P<0.05)。C3质量浓度仅在16 ℃组中显著升高 (P<0.05)。
图2 不同温度对珍珠龙胆石斑鱼非特异性免疫的影响注：柱上不同英文字母表示各组间存在显著差异 (P<0.05)，图3同此。Fig. 2 Effects of different temperatures on non-specific immunity of grouperNote: Different letters indicate significant difference among groups (P<0.05). The same case in Fig. 3.
2.4 暂养温度对珍珠龙胆石斑鱼抗氧化能力的影响
同其他组相比，16 ℃组肝脏组织中SOD活性显著升高 (P<0.05)，18 ℃组无显著变化 (P>0.05)，20和24 ℃组显著降低 (P<0.05)。各组CAT活性均存在显著差异 (P<0.05)，其中，16、18和20 ℃组的CAT活性较暂养前显著升高 (P<0.05)，24 ℃组显著降低 (P<0.05)。暂养48 h后GPx活性显著下降 (P<0.05)，且在16～20 ℃范围内，随着保活温度的降低，GPx活性显著上升(P<0.05)。肝脏组织中的MDA质量摩尔浓度经暂养后显著升高，不同温度组之间存在显著差异(P<0.05)，在24 ℃组中达到最高水平，为新鲜对照组的20倍 (图3)。
图3 不同温度对珍珠龙胆石斑鱼抗氧化能力的影响Fig. 3 Effects of different temperatures on antioxidant capacity of grouper
2.5 暂养过程中水质指标的变化
随着暂养时间的延长，水面漂浮的黄白色泡沫逐渐增多，水体逐渐发黄、变浑浊，水中珍珠龙胆石斑鱼体表脱落物和代谢废物增多。暂养过程中水体总氨氮 (TAN) 质量浓度和电导率呈不断上升的趋势，其中24 ℃组的增速最快。在0～48 h内，各组TAN质量浓度增速缓慢，暂养时间超过48 h后，18、20和24 ℃组TAN质量浓度迅速上升。暂养过程中，16 ℃组的pH无显著变化 (P>0.05)，24 ℃组的显著下降 (P<0.05，图4)。
图4 不同温度对暂养过程中水质指标的影响注：不同英文字母表示差异显著 (P<0.05)。Fig. 4 Effects of different temperatures on water quality indexes during acclimation processNote: Different letters indicate significant difference (P<0.05).
3.1 不同暂养温度对珍珠龙胆石斑鱼成活率的影响
珍珠龙胆石斑鱼是暖水性海水鱼，暂养温度降至14 ℃时，存活时间显著低于其他温度组，原因可能是低温或者温度骤降破坏了鱼体内环境稳态，其物质代谢[13]、免疫系统[14]、细胞凋亡[15]、组织形态[16]、基因表达[17]等均受到影响，导致鱼体的抵抗力下降，同时引起鱼体组织内部发生氧化损伤，从而造成鱼体死亡。秦旭等[4]在研究彭泽鲫的低温无水保活时发现，相对于休眠温度7 ℃，14 ℃时鱼体既能维持极低的耗氧量，又能通过自身调节维持正常代谢，更适合作为彭泽鲫的保活温度。通过在暂养过程中实施梯度降温诱导活鱼进入休眠状态，在长途保活运输过程保持与暂养水温一致，使得活鱼的能量代谢降低，保障长途运输的成活率。相对于24 ℃组，低温 (16、18 ℃) 组的鱼体存活时间显著增加，16 ℃组鱼体的存活时间约为24 ℃组的1.73倍。由此可见，过高或过低的温度均不利于珍珠龙胆石斑鱼的存活。
3.2 暂养温度对珍珠龙胆石斑鱼非特异性免疫的影响
血清转氨酶活性被认为是肝脏受损最敏感的指标之一，当肝细胞受到损伤时，细胞膜通透性改变，胞浆中的ALT和线粒体中的AST会外渗进入血液[18]。CK是一种细胞质酶，在Mg2+的帮助下可逆催化ATP和磷酸肌酸之间的磷酸转移，参与能量稳态，以骨骼肌和心脏中含量为多。研究发现，低温胁迫对斜带石斑鱼 (E. coioides) 和荷那龙罗非鱼 (Oreochromis hornorum) 的肝细胞和心肌细胞造成了难以修复的损伤，导致血清中的AST、ALT和CK活性在胁迫期间不断上升[19-20]。在16 ℃暂养48 h后ALT、AST和CK活性同暂养前相比无显著变化，原因可能是低温条件下鱼体代谢水平低，外界环境中氨类代谢废物的含量在鱼体的承受阈值内，且能较好地维持体内能量代谢平衡。与16 ℃组相比，20、24 ℃ 组的 ALT、AST和 CK活性显著上升，且温度越高上升越显著。本研究结果与大口黑鲈保活试验的结果一致[21]，原因可能是鱼体能量消耗和代谢速率在20和24 ℃条件下保持较高水平，导致水体中的有害物质富集速度过快，且鱼体在暂养过程中未摄取食物，只能依靠分解自身糖原和脂肪等营养物质提供生命活动所需能量，长时间的饥饿状态和水体中高浓度的氨氮等有害物质的刺激致使鱼体能量稳态失衡，解毒调节机制被破坏，诱发肝脏及心肌组织的损伤。
溶酶体对由免疫应激或应激源触发的活性氧(ROS) 较敏感，一旦ROS过量产生，会增加溶酶体膜的通透性和溶酶体蛋白水解酶 (如AKP、LZM等) 的释放[22]。24 ℃暂养48 h后血清中AKP和LZM活性显著升高，原因可能是24 ℃条件下鱼体代谢速率较高，ATP消耗量增多，水体中有害物质的富集速度高于低温组，鱼体为了维持能量代谢的正常运行、抵抗氧化应激所导致的炎症反应，加速了AKP和LZM的释放，借此来维持内部平衡，这与半滑舌鳎 (Cynoglossus semilaevis) 急性温度胁迫和黄颡鱼 (Pelteobagrus fulvidraco) 慢性氨氮胁迫的实验结果相似[23-24]。
TP包括ALB和GLB，在调节渗透压、运输代谢物质、修复机体受损组织等方面发挥着重要作用；
其中，ALB几乎全由肝脏合成，当肝脏组织受损或机体长期处于不良状态时，蛋白补偿机制被破坏，导致ALB偏低[25-26]。同新鲜对照组相比，血清TP在18、20 ℃组中无显著变化，表明在此温度下鱼体蛋白代谢功能在暂养过程中正常运转。16 ℃组GLB和TP显著上升，可能是由于低温应激蛋白的合成导致血清TP质量浓度增加。24 ℃组血清蛋白质量浓度显著降低，原因可能是石斑鱼在此温度下暂养48 h后，其肝脏组织受损，造成蛋白质的合成受阻，且由于鱼体长时间处于饥饿胁迫状态，为了满足机体内部功能的正常运转，消耗了血清中的部分蛋白质来提供能量。
补体系统参与机体的特异性和非特异性免疫机制，其主要作用为协助清除抗原，是免疫防御系统的一个重要组成部分，C3作为补体系统的中心因子，在3种补体系统激活途径 (即经典途径、凝集素途径和替补途径) 中发挥着核心作用[27]。应激反应造成组织损伤后，大部分补体成分的合成会增强[28]。有研究表明，鱼类等变温动物的补体系统对温度变化更为敏感[29]。C3质量浓度仅在16 ℃组显著升高，其余各组间无显著差异，原因可能是珍珠龙胆石斑鱼的补体系统对温度的变化较为敏感，为了抵御低温胁迫对组织造成的损伤，补体系统被诱导激活合成了C3，参与肝脏能量代谢和调节肝损伤再生，以提高机体的免疫能力，降低对疾病的易感性。
3.3 暂养温度对珍珠龙胆石斑鱼抗氧化能力的影响
低温和氨等不利环境因素会诱导鱼体产生氧自由基并导致氧化应激，为了平衡细胞内的氧化还原状态，生物体通过改变抗氧化酶 (SOD、CAT和GPx) 的活性以清除氧自由基，抵消氧化应激并防止氧化损伤，抗氧化酶活性是监测生物体抗氧化状态的重要指标[30]。CAT与SOD清除超氧化物自由基，产生H2O和O2[31]。GPx可以清除细胞呼吸代谢过程中产生的过氧化物和羟自由基，从而减轻细胞膜多不饱和脂肪酸的过氧化作用[32]。MDA是脂质过氧化的最终产物，体内MDA含量表征活性氧和自由基对脂质的氧化损伤程度[33]。低温 (16、18 ℃)组肝脏SOD、CAT活性较暂养前显著升高，原因可能是在低温条件下鱼体活性氧自由基水平和MDA含量增加，为了维持身体组织抗氧化水平的平衡，鱼体内部生理调节导致了抗氧化酶活性的补偿性增加，通过消耗抗氧化物质来抵抗氧化反应带来的损伤。随着温度的升高，肝脏SOD、CAT、GPx水平呈显著下降趋势，这可能与MDA浓度的显著增加有关。在长期氨类代谢废物的胁迫下，抗氧化酶的活性受到抑制，使鱼体的抗氧化能力降低，不能有效清除氧自由基，过量的氧自由基加速脂质过氧化和增加MDA浓度，机体自由基的防御系统被破坏，导致酶活性迅速下降，免疫系统失衡，因此抗氧化酶活性明显低于对照组。这与红鳍东方鲀(Takifugu rubripes) 和斑点石斑鱼(E. fuscoguttatus♀×E. lanceolatu ♂) 在氨氮胁迫下抗氧化酶活性的变化相似[34-35]。
3.4 暂养过程中水质指标的变化
氨作为鱼类蛋白质代谢的主要排泄产物之一，占氮排泄物总量的70%～90%，以离子氨和非离子氨 (NH3) 两种形式存在。NH3因其较强的脂溶性和不带电荷的特性，能穿透大部分生物膜并对机体各器官造成严重损害[36]。研究表明，NH3浓度的增加会导致鱼体生长发育障碍、组织损伤、免疫紊乱和死亡率增加[37-38]。本研究中，相对于高温 (20、24 ℃) 组，低温 (16、18 ℃) 组水体中 TAN质量浓度下降了23.1%～84.5%，这与黄盖鲽 (Pseudopleuronectes yokohamae)、梭鲈 (Sander lucioperca)及大泷六线鱼 (Hexagrammos otakii) 的排氨率随温度降低而下降的研究结果相一致[39-41]，表明低温条件可以有效降低珍珠龙胆石斑鱼代谢废物的排放量，减缓水体中氨氮等物质的富集速度，从而达到延长保活流通的目的。在0～48 h内，各组TAN质量浓度增速缓慢，暂养时间超过48 h后，18、20和24 ℃组TAN质量浓度迅速上升，原因可能是硝化细菌、氨氮好氧菌等在不同时间形成了优势种群，使氨氮先小幅度波动后迅速上升[42]。保活过程中各组pH基本维持在7.0以上，尽管存在一定的差异，但均在珍珠龙胆石斑鱼适宜生存的pH范围内。
本研究以0.5～1.0 ℃·h−1的速率将珍珠龙胆石斑鱼降温至16、18、20、24 ℃条件下进行暂养试验，结果显示，16 ℃时石斑鱼在禁食条件下的存活时间最长 (109 h)。随着暂养时间的延长，水质逐渐恶化，鱼体非特异性免疫和抗氧化能力受到不同程度的影响，导致肝脏、心肌等组织器官出现不可逆损伤，加速了石斑鱼在暂养过程中的死亡。相较于对照组，16 ℃暂养48 h后鱼体血清中ALT、AST、CK、AKP、LZM活性无显著变化，血清TP、GLB和C3浓度显著增加，肝脏抗氧化酶活性升高，总体优于其他温度组。结果表明，16 ℃暂养温度下珍珠龙胆石斑鱼非特异性免疫和抗氧化系统调控能力保持在较高水平，减缓了保活过程中珍珠龙胆石斑鱼肝脏的氧化应激损伤，能更好地维持机体能量物质代谢平衡，延长鱼体的存活时间，该暂养温度条件可为制定珍珠龙胆石斑鱼保活运输策略提供重要参考。
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