秦建品，许诣，沈文婷，赵梦
(湖北文理学院附属医院，襄阳市中心医院儿科，湖北襄阳 441021)
支气管哮喘发病率呈逐年上升趋势，目前其具体的发病机制尚未完全明确，阐明支气管哮喘发病机制对改善其预后具有重要意义[1]。研究表明，微小RNA(microRNAs，miRNAs)通过调控靶基因，参与支气管哮喘的发生、发展及转归，并证实miR-155、miR-21与哮喘发生密切相关[2]。miR-21可通过调控靶基因活化转化生长因子-β(TGF-β)/ Smad信号通路，促进哮喘小鼠的气道重塑[3]。长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)在支气管哮喘中呈异常表达，且与炎症因子水平有关，并可用于诊断支气管哮喘[4]。新近研究显示，在严重哮喘中癌症易感候选基因7(cancer susceptibility candidate 7，CASC7)通过靶向miR-21，抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路，增加皮质类固醇的敏感性[5]。目前miR-21、LncRNACASC7在支气管哮喘急性发作期患儿外周血中的水平变化与病情严重程度以及对疾病诊断价值尚无明确研究。本研究旨在检测支气管哮喘急性发作期、缓解期患儿外周血LncRNACASC7、miR-21的表达水平并研究其临床价值。
1.1研究对象 选择2020年6月至2021年10月在襄阳市中心医院收治的115例支气管哮喘急性发作期患儿作为急性发作期组，其中男61例，女54例，年龄(5.8±1.7)岁，根据支气管哮喘防治指南[6]将患儿分为轻度组45例，中度组39例，重度组31例。支气管哮喘缓解期患儿97例作为缓解期组，其中男50例，女47例，年龄(6.2±1.9)岁。纳入标准：(1)符合急性发作期与缓解期支气管哮喘诊断标准[6]；
(2)年龄小于14岁。排除标准:(1)合并肺结核、支气管扩张、心源性哮喘等其他呼吸系统疾病患者；
(2)呼吸道、肺部以外的其他器官感染；
(3)1个月内服用糖皮质激素或1周内使用支气管扩张剂。另选择体检健康儿童(无哮喘史)100例作为健康人对照组，其中男55例，女45例，年龄(5.7±1.8)岁。本研究经襄阳市中心医院医学伦理委员会审核批准(No.XY-2020-1729)，患者及家属知情同意。
1.2主要试剂与仪器 CFX96荧光定量PCR仪、Microfugr 20R高速冷冻离心机(美国Bio-Rad公司)，MR-96A酶联免疫检测仪(武汉科尔达医疗科技公司)，PA-600免疫比浊仪(深圳普门科技股份有限公司)，肺功能TAED检测仪(美国通用电气公司)，NanoDrop OneC型超微量紫外分光光度计(赛默飞世尔科技有限公司)。Trizol试剂(上海碧云天生物科技有限公司)，逆转录试剂盒PrimeScriptRTReagent Kit、SYBR Green荧光定量PCR试剂盒(日本TaKaRa公司)，TNF-α、IL-6酶联免疫吸附试剂盒(北京全式金公司)，超敏C反应蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
1.3研究方法
1.3.1标本采集 采集急性发作期组、缓解期组患儿入院第1天时(健康儿童于体检当日采集)的空腹外周血10 mL，置于肝素钠抗凝管中。取5 mL于4 ℃、3 000 r/min离心10 min，收集血清样本，置于-80 ℃保存。另取5 mL外周血，用于分离单个核细胞，置于-80 ℃保存。
1.3.2RNA提取及逆转录反应 取上述各组的外周血标本，用Trizol试剂提取外周血单个核细胞中的总RNA，采用NanoDrop OneC型超微量紫外分光光度计检测并收集吸光度(A260 nm/A280 nm)值为1.8～2.0的样本，将浓度定量为0.5 μg/μL，用于后续试验。按照PrimeScriptRTReagent Kit说明书进行逆转录反应，cDNA样本置于-20 ℃保存。
1.3.3实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测LncRNACASC7、miR-21的表达 采用基于TB Green染料RT-qPCR法检测血清样本中LncRNACASC7、miR-21的表达水平，引物序列见表1，并由上海生工生物工程有限公司合成。按照SYBR Green荧光定量PCR试剂盒说明书进行PCR扩增，RT-qPCR反应体系为20 μL，包括TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，正、反向引物(10 μmol/L)各0.8 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL。反应条件：95 ℃预变性10 min；
94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环。以GAPDH、U6为内参照，采用2-ΔΔCt法计算LncRNACASC7和miR-21相对表达量，公式:ΔΔCt=[(实验组Ct目的基因-实验组Ct内参基因)-(对照组Ct目的基因-对照组Ct内参基因)]。每组设3个复孔，重复3次。
表1 RT-qPCR引物序列
1.3.4hs-CRP检测 取外周血2 mL置于EDTA-K2抗凝管中，送至本院检验科，按照普门PA-600免疫比浊仪及hs-CRP检测试剂盒说明书检测hs-CRP的表达水平，参考区间：0.68～0.88 mg/L。
1.3.5ELISA法检测血清IL-6、TNF-α水平 取冻存的血清样本200 μL，恢复至室温，按照TNF-α、IL-6酶联免疫吸附试剂盒说明书进行检测。通过NanoDrop OneC型超微量紫外分光光度计检测样本A450 nm值，并计算样本浓度。IL-6参考区间：370～460 ng/L；
TNF-α参考区间：0.74～1.54 ng/mL。
1.3.6肺功能指标检测 所有研究对象均在呼吸内科检测以下肺功能评价指标，包括第1秒用力呼气容积(forced expiratory volume in one second，FEV1)、用力肺活量(forced vital capacity，FVC)、最大呼吸峰流速(peak expiratory flow rate，PEF)[8]，测量3次，取其均值。FEV1参考区间：>4.26 L，FVC参考区间：>4.13 L，PEF参考区间：450～600 L/min。
2.13组观察对象一般资料、炎症因子及肺功能指标的比较 健康人对照组、缓解期组、急性发作期组患儿之间的年龄、性别、哮喘家族史比例差异无统计学意义(P>0.05)，但血清炎症因子hs-CRP、TNF-α、IL-6的表达水平依次升高(P<0.05)，而肺功能指标FEV1、FVC、PEF的表达水平依次降低(P<0.05)。与健康人对照组比较，急性发作期组、缓解期组患儿外周血LncRNACASC7的表达水平降低，而miR-21的表达水平升高(P<0.05)；
与缓解期组比较，急性发作期组患儿外周血LncRNACASC7的表达水平降低，而miR-21的表达水平升高(P<0.05)，见表2。
2.2急性发作期不同严重程度哮喘患儿外周血LncRNACASC7、miR-21表达水平的比较 轻度组、中度组、重度组哮喘患者外周血LncRNACASC7的表达水平依次降低，而miR-21的表达水平依次升高(P<0.05)，见表3。
表3 急性发作期不同严重程度哮喘患儿外周血LncRNA CASC7、miR-21表达水平的比较
2.3支气管哮喘急性发作期患儿外周血LncRNACASC7、miR-21的表达与炎症因子和肺功能指标的相关性 相关性分析显示，支气管哮喘急性发作期患儿外周血LncRNACASC7与miR-21的表达水平呈负相关性(r=-0.568，P<0.05)。支气管哮喘急性发作期患儿外周血LncRNACASC7与hs-CRP、TNF-α、IL-6水平呈负相关，而与FEV1、FVC、PEF呈正相关(P<0.05)；
miR-21与hs-CRP、TNF-α、IL-6水平呈正相关，而与FEV1、FVC、PEF呈负相关(P<0.05)，见表4。
表4 支气管哮喘急性发作期患儿外周血LncRNA CASC7、miR-21的表达与炎症因子和肺功能指标的相关性
2.4LncRNACASC7、miR-21对支气管哮喘急性发作期、缓解期患儿的鉴别诊断价值 将支气管哮喘急性发作期患儿作为急性发作期组，缓解期患儿作为缓解期组，绘制ROC曲线。根据Youden指数最大原则，明确cut-off值，并计算ROC曲线下面积(AUCROC)、敏感性、特异性，评估LncRNACASC7、miR-21单独及联合检测对支气管哮喘急性发作期的诊断效能。结果显示，外周血LncRNACASC7鉴别诊断支气管哮喘急性发作期患儿的AUCROC为0.863(95%CI:0.809～0.906)，当cut-off值为0.76时，其敏感性为78.26%，特异性82.47%。外周血miR-21鉴别诊断支气管哮喘急性发作期患儿的AUCROC为0.922(95%CI:0.877～0.954)，当cut-off值为2.14时，其敏感性为82.61%，特异性为83.51%。二者联合检测的AUCROC为0.955(95%CI:0.918～0.979)，敏感性为89.57%，特异性为88.66%，见图1。
图1 LncRNA CASC7、miR-21鉴别诊断支气管哮喘急性发作期患儿的ROC曲线
支气管哮喘是一种慢性气道炎症性疾病，研究证实，促炎症反应及抑炎症反应失衡导致气道处于慢性炎症状态，引发气道高反应性而发生该疾病[9]。hs-CRP、TNF-α、IL-6与支气管哮喘发病机制及转归密切相关，TNF-α还可促进炎症细胞浸润，导致肺损伤及肺功能下降，而FEV1、FVC、PEF是反映肺功能的常见指标[10]。本研究结果发现支气管哮喘发病伴随炎性因子分泌增加，以及肺功能异常，证实支气管哮喘发病与炎症反应有关，并且随着患儿病情加重，肺功能损伤严重。
LncRNACASC7能够加强重症哮喘患者对激素治疗敏感性，其通过调控miR-98-5p/SIRT3轴，抑制气道炎症因子分泌，抑制支气管平滑肌细胞增殖[11]。另有研究显示，过表达LncRNACASC7可降低IL-1β、IL-6和TNF-α的水平[12]。本研究显示，支气管哮喘急性发作期患儿外周血LncRNACASC7表达水平降低，提示LncRNACASC7可能通过调控炎症反应，参与急性发作期哮喘的发生、发展[11-12]。最近有报道发现[13]，在肺结核外周血单核细胞中LncRNACASC7表达下调，且活动性肺结核组LncRNACASC7高于非活动性肺结核组。本研究结果表明，LncRNACASC7的表达水平随病情加重而降低，且LncRNACASC7与炎症因子、肺功能指标具有相关性，提示外周血LncRNACASC7异常表达与病情严重程度密切相关，推测由于LncRNACASC7水平受抑制，导致炎症加重，最终表现为患儿病情严重程度加重。
miR-21在参与支气管哮喘炎症反应、气道重塑等方面发挥重要作用[14]。尚朋娟等[7]研究显示，支气管哮喘患儿血清中miR-21呈高表达，与TNF-α、IL-17、IL-6呈显著正相关。本研究中，急性发作期组患儿外周血miR-21表达水平升高，与先前报道的结果类似。研究证实，抑制miR-21表达可抑制肺泡M2巨噬细胞的极化，降低TH2嗜酸性气道炎症，同时降低气道反应和气道重塑过程[15]。本研究显示，miR-21表达水平随着病情加重而升高，与邓颖云等[16]研究结果一致，且miR-21表达水平与炎症因子、肺功能指标存在明显相关性，笔者推测miR-21与支气管哮喘疾病发作期严重程度确有关系，病情越严重，其水平越高，分析原因可能是miR-21水平升高通过调节促炎细胞因子分泌，加重气道炎症，以及细胞周期调节、气道重塑有关。此外，LncRNACASC7与miR-21表达水平呈负相关性，提示LncRNA-CASC7可能通过调控miR-21表达，参与儿童支气管哮喘的发生、发展。笔者进一步绘制ROC曲线以评估LncRNACASC7、miR-21对支气管哮喘急性发作期的鉴别诊断价值，结果发现二者联合鉴别诊断的AUCROC可增至0.955。
综上所述，支气管哮喘急性发作期患儿外周血中LncRNACASC7呈低表达，miR-21呈高表达，且与病情严重程度有关，二者联合对支气管哮喘急性发作期有一定的鉴别诊断价值。然而，外周血LncRNACASC7、miR-21的表达参与调控支气管哮喘的具体调控机制尚未明确，今后需扩大样本量，并通过细胞试验等深入探究。
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