闫慧，黄蕾，马小红，哈灵侠，赵君利，张倩，闫有圣，刘春莲*
(1.宁夏医科大学总医院生殖医学中心，银川 750004；
2.生育力保持教育部重点实验室，银川 750004；
3.首都医科大学附属北京妇产医院产前诊断中心，北京 100026)
卵巢抵抗综合征(resistant ovary syndrome，ROS)又称卵巢不敏感综合征(insensitive ovary syndrome，IOS)，即在40岁前患有高促性腺激素低雌激素性闭经，卵巢体积正常，有大量的始基卵泡及初级卵泡，抗苗勒管激素(AMH)值正常或偏高，对促性腺激素不反应，临床症状可表现为原发或继发闭经。该疾病需要与卵巢功能减退(premature ovarian insufficiency，POI)相鉴别。ROS病因不明，可能与促性腺激素受体如卵泡刺激素受体(FSHR)缺陷有关，目前已报道多种致病性FSHR变异，一些变异可能导致ROS[1-3]。本研究对宁夏医科大学总医院生殖医学中心收治的1例确诊为ROS的年轻原发性闭经患者的临床特征及遗传学资料进行回顾性分析，并对相关文献进行整理和复习，以期为今后的临床实践提供参考。
一、研究对象
先证者来自宁夏医科大学总医院生殖医学中心，在知情同意的前提下采集了患者及父母、兄长的外周静脉血各5 ml，并获取了先证者的临床资料。该研究经宁夏医科大学总医院生殖医学中心伦理委员会批准(编号2019-030)。
二、研究方法
1.外周血基因组DNA提取：采用肘静脉血约5 ml，EDTA-2Na抗凝，用DNA提取试剂盒(TIANamp Blood DNA Kit，#DP348-03，北京天根生化科技)按照使用说明提取基因组DNA，测定DNA的浓度和纯度，至少约有1.5 μg的基因组DNA用于建库。
2.全外显子组测序：使用上海翊圣生物DNA转座酶法建库试剂盒(Hieff NGSOnePot DNA Library Prep Kit for Illumina)进行DNA片段化、末端修复和接头连接过程。用xGen Exome Research Panel v1.0试剂盒(Integrated DNA Technologies公司，美国)进行全外显子组文库捕获文库构建。使用PE150模式在Illumina HiSeq 2500(San Diego，加拿大)测序平台上进行双端测序。
3.测序数据分析：测序数据经过过滤与评估，过滤掉低质量reads(Q30<85% reads)数据。通过Burrows-Wheeler Aligner(BWA)软件将数据与人类参考基因组(UCSC hg19，https：//genome.ucsc.edu/)对比。使用Genome Analysis Toolkit(GATK)v3.70对测序结果与参考基因组进行比对，找出样品中存在的变异信息，包括SNV、InDel等。使用dbSNP、1000Genome、Clinvar等数据库以及SIFT、Polyphen-2、GERP等软件对其进行注释及功能预测。
4.家系成员变异位点的Sanger测序验证：根据目标致病基因突变位点，从GenBank数据库中获取FSHR的基因组DNA序列，用软件Primer5设计可特异性扩增该基因c.299+2T>G突变位点的外显子上下游引物。上游引物：5’-GCAGGCAACAGGATGAGACT-3’，下游引物：5’-GAGCCACAGCCTTCGACTTA-3’。使用TC-XP-G PCR仪(杭州BIOER)对DNA样本(包含目标基因变异位点的序列)进行扩增，扩增后电泳条带清晰、特异，采用Life 3500 Dx测序仪(ABI，美国)进行Sanger测序。将所测出的FSHR序列与Nucleotide数据库(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Nucleotide)中的FSHR序列进行对比分析以发现FSHR基因变异。利用Mutation Surveyor软件进行分析，并结合文献及1000Genome、ExAC、ESP、HGMD、ClinVar等多种数据库进行基因变异致病性的判断。
5.变异位点的致病性分析：参照美国医学遗传学和基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)相关指南进行变异致病性分析。
一、临床资料
1.基本情况：患者，女(先证者V2)，24岁，因“未避孕未孕5年”于2022年1月就诊于宁夏医科大学总医院生殖医学中心，患者月经初潮16岁，需药物行经，就诊时临床诊断原发性闭经，无结核病及外伤史，无盆腔手术史；
经尿促性素粉针剂促排3个周期无优势卵泡发育。经临床资料与辅助检查诊断为ROS。母亲有正常月经史，绝经年龄为48岁；
无特殊家族史。先证者母亲的祖母与父亲的祖父为亲兄妹，家系图谱详见图1。
图1 病例家系图谱
2.体格检查：患者身高171 cm，体重55 kg，外观发育未见异常，无腋毛，乳房发育不良，阴毛和外生殖器发育正常。
3.辅助检查：B超显示单侧多囊卵巢改变，直径2～3 mm卵泡数大于12个，子宫略小，ABO血型O型，RH(+)，染色体核型正常为46，XX；
既往甲状腺激素水平正常，肝肾功能未见明显异常，激素水平详见表1。
表1 患者血清激素水平及参考值
二、全外显子组测序及变异位点分析结果
原始数据经过全外显子组测序，发现先证者存在FSHR经典剪切变异NM_000145.4 c.299+2T>G并为纯合型(图2)，该变异在dbSNP和HGMD均未收录，是尚未报道的新变异。根据ACMG解读指南，该位点为致病性变异。
三、Sanger测序验证
Sanger测序结果表明，先证者存在FSHR剪切变异c.299+2T>G，且兄长与先证者一致，父母(Ⅳ1、2)存在FSHR剪切变异c.299+2T>G并为杂合型(图2)。Ⅳ1、2为四代近亲结婚，根据家系图谱及检测结果，推测该新发位点可能源于I1或者I2。
卵泡刺激素(FSH)是由腺垂体分泌的糖蛋白，与FSHR相互作用参与调控卵泡发育和卵巢功能。FSHR长约190 kb，位于染色体2p21-p16[4]，是膜受体的G蛋白偶联受体(GPCR)超家族成员，其编码区由10个69～1 234 bp的外显子和9个108 bp～15 kb的内含子组成，人类FSHR蛋白由695个氨基酸残基组成。FSHR具有广泛的胞外结构域，与FSH结合，连接信号特异性亚域或铰链区，而7个跨膜结构域参与受体的激活，并将激活过程传递到由氨基酸序列组成的细胞内环[5]。FSHR具有组织特异性，在女性颗粒细胞和男性支持细胞中高表达。
图2 FSHR基因c.299+2T>G位点测序峰图(图中红色框为变异位点碱基)
一、FSHR新发现剪切变异c.299+2T>G是导致ROS的关键因素
ROS病因尚不明确，可能是由于FSHR结构异常，导致下游信号通路受阻，雌激素合成障碍，从而影响卵泡发育，而FSHR的转录和翻译受FSHR基因调控，故FSHR基因变异可能导致卵泡发育异常造成ROS[1]。目前Clinavar网站(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar)统计的FSHR突变位点共计165个，其中致病性26个，可能致病14个，良性32个，可能良性24个，其他69个，各种类型包含的位点详见表2。Khor等[2]报道FSHR致病性变异c.182T>A(p.Ile61Asn)和c.2062C>A(p.Pro688Thr)可引起ROS。本文发现的FSHR新剪切变异c.299+2T>G为经典剪切变异，可能导致>10%长度的蛋白改变[6]，从而导致基因功能缺失。FSHR在维持正常生殖功能中发挥至关重要的作用。有文献报道，FSHR突变影响患有子宫内膜异位症的不孕症患者的激素表达及辅助生殖技术助孕结局[7]。FSHRrs6166(N680S)位点携带者的激素敏感性更高，可用于预测辅助生殖技术中卵巢过度刺激综合征(OHSS)的发生[8]及活产抱婴率的情况[9]。一项纳入16项研究的Meta分析发现FSHRrs6166多态性可能是亚洲人群POI的一种潜在的遗传生物标志物[10]。亦有研究发现FSHR多态性可改变卵巢对外源性FSH的反应，增加多囊卵巢综合征(PCOS)的发生风险，且影响其临床特征和治疗结果[11-12]。Dierich等[13]发现FSHR缺乏可能导致卵巢发育不全及某些男性特异性不孕。目前已报道的中国人群FSHR的致病性变异较少，李汶等[3]报道了FSHRc.419delA(p.Lys140Argfs*16)纯合突变和c.1510C>T(p.Pro504Ser)纯合突变可导致ROS的发生。
表2 FSHR突变位点临床意义
续表
二、家系临床资料分析
不同突变位点会导致相应的临床表现及症状[14]，我们分析了患者的临床数据及资料。阴式B超下显示患者的单侧卵巢呈现多囊卵巢样改变，表明含有初级或次级卵母细胞期停止发育的卵泡，由于细胞膜上FSHR分子数量减少，卵泡发育成熟后期缺少FSH的作用，导致卵母细胞成熟障碍。本研究中先证者哥哥与其具有同样的基因型，但遗憾的是，其哥哥因个人原因拒绝提供临床资料及进行进一步检查。先证者的AMH水平偏高为4.67 ng/ml，说明FSHR对于AMH的产生或窦前卵泡的发育不是必需的。Anagnostou等[15]研究发现携带Ser(Ser680Asn)等位基因的女性卵泡数量及卵母细胞较多，Asn/Asn女性血清和卵泡液中的AMH水平低，但无显著性差异(P>0.05)。与其他FSHR突变导致FSH活性降低的患者类似，本病例可能初级或次级滤泡膜上的正常FSHR显著降低，但可能在青春期合成了足够的雌激素来刺激部分乳房发育。而因卵泡缺失而导致卵巢早衰的女性AMH值很低甚至检测不到，这也成为与POI鉴别的关键要点[16]。抑制素B(Inhibin B)属于转化生长因子β(TGF-β)超家族，血清中高水平的抑制素B直接对垂体产生负反馈，导致FSH下降，因此其可作为预测卵巢反应的更为直接的标记物，是FSH分泌的负调控因子。先证者抑制素B水平正常(57.00 pg/ml)，符合患者卵巢内大量初级或次级卵母细胞存在的体征[17]。
三、ROS患者临床助孕管理策略
对于ROS患者的治疗策略，常规可给予雌孕激素替代治疗维持月经周期；
不孕症的处理常给予使用赠卵的建议。随着测序技术的发展，FSHR的遗传变异也是不断发展的药物遗传学领域的研究热点，可作为有价值的个体化治疗方案的工具。有研究根据ROS患者的FSHR突变基因类型、位点突变的功能性以及闭经的类型，分析基因型与表型的关系，可用于推算携带不同FSHR突变位点的患者是否适合进行未成熟卵母细胞体外成熟培养(IVM)技术。Galvão等[18]对9例ROS患者进行了24个IVM周期，平均获卵数为(11.5±10.4)个，IVM培养后有(3.4±3.1)个卵母细胞成熟，活产5例(16.7%)，因此认为IVM是ROS患者极具价值的助孕方式。Li等[19]报道了1例携带了4个良性变异位点c.-29G>A，c.299+33C>T，c.919G>A(p.Ala307Thr)和c.2039G>A(p.Ser680Asn)的ROS患者，通过IVM技术分娩了健康的婴儿。Benammar等[20]对1名携带FSHRArg283Trp及Pro600Thr杂合突变的患者，经过3次失败的常规IVF助孕后，行IVM培养，尽管只有不到50%(7/16)的卵母细胞发育成熟，但所有成熟卵母细胞均已受精，1枚胚胎成功获得活产。结合其他成功的个案报道[21-22]，我们掌握了更多关于FSHR基因型-表现型的相关性，为改善家庭遗传咨询提供了更多指导意见，并提高其生活质量，如激素替代治疗促进乳房发育，或行卵母细胞冷冻保存为未来妊娠做准备。
鉴于不同的FSHR突变位点导致其相应的氨基酸改变，我们后续将进一步开展FSHR新发现剪切变异c.299+2T>G的功能学基础研究，探寻效应子的耦合、与适配蛋白的相互作用以及下游细胞内信号通路机制，以期丰富FSHR的作用机理，为临床治疗提供参考。
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