唐锐敏 石源睿 徐子舟 贾小云
“普薯32号”中基因的克隆与序列分析
唐锐敏石源睿徐子舟贾小云
（山西农业大学生命科学学院山西晋中030801）
作为我国的一种重要粮食作物，甘薯在抵抗饥荒、保障粮食安全方面发挥着重要作用。近年来，对甘薯的营养和保健功效的研究越来越多，许多以甘薯为原料的新型食品被开发出来。β-胡萝卜素是甘薯中一种重要的生物活性物质，能够转化为维生素A，维持人类眼睛和皮肤的健康，从而改善夜盲症、皮肤粗糙的状况。番茄红素β-环化酶（LCYb）是参与β-胡萝卜素合成的关键酶。本研究从橘肉甘薯品种“普薯32号”中分离得到基因，并对其进行序列分析和编码蛋白的理化性质分析等。结果表明：基因的开放阅读框长度为1 506 bp，编码501个氨基酸。该基因编码蛋白的相对分子质量为56.45 kDa，理论等电点为8.02，属于亲水性非跨膜蛋白。系统进化分析结果表明：甘薯LCYb与三裂叶薯LCYb的亲缘关系最近。这些结果为进一步研究甘薯LCYb的功能以及调控β-胡萝卜素合成的机制提供理论基础。
甘薯；
基因；
基因克隆；
β-胡萝卜素；
序列分析
甘薯（(L.)Lam.）是世界主要的粮食作物之一，其在亚洲的种植面积居世界首位，非洲次之[1]。根据成熟期薯肉颜色的不同，可将其分为白心甘薯、黄心甘薯、橙心甘薯和紫心甘薯等[2]。彩色甘薯块根因富含类胡萝卜素和花青素等次生代谢物，具有预防心血管疾病、抗肿瘤、调节免疫活性等功效，对人类健康具有巨大的潜在价值，因此成为开发功能食品的理想资源[3]。
类胡萝卜素是一类重要天然色素的总称，普遍存在于动物、高等植物、真菌、藻类和细菌中[4-5]。β-胡萝卜素作为类胡萝卜素家族中的重要一员，在植物体内具有多种生物学功能[6-8]。例如，β-胡萝卜素可作为光合色素参与光合作用；
能够防止植物因光氧化而受到损害[9-10]；
能使花瓣和果实颜色鲜艳，从而吸引昆虫等动物授粉、传播种子[11]；
还参与植物响应非生物胁迫的途径[12-13]。对人类而言，β-胡萝卜素在抗氧化、解毒、预防心血管疾病、保护肝脏等方面具有重要的生理作用[14]。同时，β-胡萝卜素也是维生素A的前体，可以预防夜盲症和视力丧失，有助于维持免疫系统的正常功能[15]。
在植物体内，β-胡萝卜素的合成过程中需要多种关键酶的参与。异戊烯焦磷酸（IPP）和二甲基丙烯基二磷酸（DMAPP）经过一系列的氧化还原反应合成β-胡萝卜素[16]，其中番茄红素环化酶（LCY）调控红色的番茄红素转变为橙色的β-胡萝卜素。研究表明，番茄红素与β-胡萝卜素在植物体内所占比例的不同导致植物体所呈现的颜色有所不同，当植物体内番茄红素积累较多，果实大多呈现红色，而当β-胡萝卜素较多时则呈现出橙色[17]。已报道的基因分为和，前者的作用是控制番茄红素转化为β-胡萝卜素，后者则是控制番茄红素向α-胡萝卜素转化[18-19]。张亚卿的研究表明，在红肉蜜柚果实发育至成熟的整个过程中，和基因的表达量迅速降低，抑制番茄红素转化为类胡萝卜素，使得红肉蜜柚汁胞积累大量的番茄红素，果实呈现红色[20]。在烟草中过表达基因会影响烟草的类胡萝卜素组分比例，同时对烤后烟叶的香气物质含量也有所影响[21]。
本研究从橙心甘薯“普薯32号”中克隆得到，利用生物信息学技术对其及其编码的蛋白质序列进行分析。研究结果为分析IbLCYb在β-胡萝卜素合成途径中的调控作用提供一定的参考，为后续甘薯品种的创新及品质的提高奠定研究基础。
1.1 植物材料、菌株及载体
试验所选甘薯品种为“普薯32号”（Pushu-32），由江苏省农业科学院徐州甘薯研究中心提供，于山西农业大学生命科学学院甘薯试验基地种植。转化所用菌株为大肠杆菌DH5α，由山西农业大学生命科学学院分子生物学实验室保存。克隆载体为PMD19-T Vector。
试验所用Prime Scrip TM RT reagent Kit反转录试剂盒、Marker DL系列，购自TaKara公司；
PCR纯化回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒购于Axy Prep公司；
RNA提取试剂盒购于北京华越洋公司；
PCR Mix聚合物购自迈维生物。
1.2 RNA的提取和cDNA的合成
取种植90 d的甘薯块根0.1 g，用液氮快速冷冻并进行研磨。每个样品做3个生物学重复。使用RNA提取试剂盒对甘薯块根的总RNA进行提取，后使用琼脂糖凝胶电泳检测所提RNA的完整性和质量，并根据TaKara反转录试剂盒说明书对所提RNA进行反转录。
1.3 IbLCYb基因克隆
根据NCBI官网上查到的甘薯基因预测序列克隆引物，F为ATGGATACTTTGCTAAAG，为TTAATCTATATCCTGTAAC。以反转录得到的甘薯cDNA为模板，对基因进行克隆。反应程序：94 ℃预变性2 min，94 ℃变性30 s，43.6 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃终延伸2 min。扩增产物通过凝胶回收试剂盒（Axygen Scientific Inc., Union city, USA）将目的片段回收，并与PMD19-T相连，获得重组质粒PMD19-T-。将重组质粒转入大肠杆菌DH5α，并将其涂布于含有氨苄青霉素的LB平板培养基上进行过夜培养15 h～17 h。挑取单克隆进行菌落PCR，将阳性克隆所提取的质粒送至上海生工生物公司进行测序，阳性克隆的菌液和所提质粒冻于-80 ℃保存。
1.4 甘薯IbLCYb基因的生物信息学分析
生物信息学分析软件如表1所示，对编码蛋白的亲疏水性、理化性质、跨膜结构、信号肽、二级结构、三级结构进行预测分析。利用甘薯编码的蛋白序列，通过BLASTp在NCBI数据库中搜索其他植物的蛋白序列，使用MEGA7.0软件，构建Neiber-Joing（NJ）系统发育树，Bootstrap分析重复数为1 000。
表1 生物信息学所用分析软件
2.1 橘肉甘薯“普薯32号”块根RNA的提取及IbLCYb基因克隆
利用RNA提取试剂盒提取“普薯32号”块根的总RNA，其琼脂糖凝胶电泳结果呈现出3条带，分别是5s、18s和28s（见图1A）。
以F/R为克隆引物，“普薯32号”的cDNA为模板对甘薯进行基因克隆。经琼脂糖凝胶电泳检测，得到了一条长度为1 506 bp的特异性条带，为（见图1B）。将目的片段割胶回收，连接PMD19-T载体，转化大肠杆菌后进行菌落PCR，目的片段大小与cDNA长度相一致。对含有目的片段的阳性克隆进行扩繁，提取阳性克隆的质粒寄送至生物公司进行测序，测序结果与NCBI网站上甘薯预测序列相比，相似度达99.67%（见图2），说明通过试验所得到的结果的确是甘薯基因的序列。
图1 “普薯32号”块根RNA琼脂糖凝胶电泳（A）及IbLCYb的扩增产物条带（B）
图2 IbLCYb测序结果与NCBI网站预测序列比对
2.2 甘薯IbLCYb蛋白的理化性质分析
对IbLCYb蛋白的理化性质进行分析，结果显示基因编码501个氨基酸（见图3A），IbLCYb蛋白的相对分子质量为56.45 kDa，理论等电点为8.02。用ProtScale和TMHMM Server v. 2.0工具在线分析该蛋白序列，可判断IbLCYb蛋白是一个无跨膜结构域的亲水不稳定蛋白（见图3B和图3C）。
图3 IbLCYb蛋白的氨基酸序列（A）、疏水性分析（B）及跨膜域分析（C）
2.3 甘薯IbLCYb蛋白结构分析
IbLCYb蛋白的二级结构由α螺旋、β片层、β转角及无规卷曲构成，其中占比最多的是无规卷曲和α螺旋，所占比例分别为41.52%和37.3%，β片层次之，为16.17%，β转角最少，为4.99%（见图4A）。其三级结构也表明，IbLCYb蛋白中无规卷曲和α螺旋最多（见图4B）。
图4 IbLCYb蛋白序列二级结构及三级结构预测分析
2.4 甘薯IbLCYb酶切位点分析
用NEBcutter V2.0在线工具对基因序列进行酶切位点的预测，结果显示基因有多个酶切位点，如Ⅰ、Ⅰ等（见图5）。该结果可为后期构建过表达载体提供依据。
图5 甘薯IbLCYb酶切位点预测
2.5 甘薯IbLCYb的系统进化分析
在NCBI网站对甘薯（）IbLCYb蛋白序列进行BLASTp比对，挑选出9条IbLCYb的同源序列，分别来自烟草（）、番茄（）、马铃薯（）、裂叶牵牛（）、三浅裂野牵牛（）、胡萝卜（subsp.）、甜椒（）、拟南芥（）和欧洲油菜（），用MEGA7.0软件对上述10条序列进行进化树分析，其中甘薯与三浅裂野牵牛LCYb序列同源关系最近（见图6）。
图6 10个物种LCYb的系统发育树
甘薯作为我国的一种重要粮食作物，在保障粮食安全方面发挥着重要作用。甘薯块根及茎叶中均含有多种生物活性物质，其中β-胡萝卜素就是重要的活性物质之一，其多烯烃结构具有较强的自由基捕捉能力，因此能很好地清除氧自由基和降低脂质氧化物含量，并明显改善机体的氧化状态[22]。
番茄红素环化酶（LYCb）作为β-胡萝卜素合成途径中的关键酶，其表达量的高低决定了植物组织的颜色。前人对柑橘、番茄、金盏菊、黄花龙胆等植物的研究表明，基因的表达与花和果实中类胡萝卜素含量呈正相关[23]。在橙色甜瓜中发现，基因表达量越高，其果实中β-胡萝卜素的含量越高[24]。王曼曼等的研究表明，在番茄果实着色期，温度变化能够抑制基因表达从而影响β-胡萝卜素的积累[25]。强光显著诱导小麦基因的表达，其体内的β-胡萝卜素含量变化与基因表达量的变化相对应[26]。
“普薯32号”又名西瓜红，是普宁市农业科学研究所选育的甘薯新品种，该品种薯块呈红皮橙心，富含胡萝卜素，营养价值和保健功能较高[27]。本研究从“普薯32号”中成功克隆到甘薯的基因，其片段大小为1 506 bp，编码501个氨基酸。利用生物信息学软件对IbLYCb蛋白进行理化性质和结构分析，发现其为无跨膜结构域的亲水性蛋白，这可能与其在植物体内发挥的功能相适应。在NCBI上搜索不同物种的LYCb序列并构建发育进化树，结果显示甘薯的LYCb的氨基酸序列与其近缘野生种三浅裂野牵牛的LYCb亲缘关系最近，表明甘薯的LYCb可能与三浅裂野牵牛的LYCb具有相似的功能和作用机制。这些结果为进一步研究IbLYCb的功能以及β-胡萝卜素的合成机制提供理论基础。
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10.3969/j.issn.2095-1205.2023.01.12
S531
A
2095-1205(2023)01-37-06
国家青年科学基金项目（31900450）；
山西农业大学科技创新基金项目（2018YJ28）；
山西省回国留学人员科研资助项目（2022- 094）
唐锐敏（1990— ），女，汉族，山西长治人，博士研究生，副教授，研究方向为薯类作物次生代谢机制。
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