食品中黄曲霉毒素B1,ELISA试剂盒检测方法的建立及验证

材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品与主要试剂 食用油、花生、谷物均为市售；黄曲霉毒素B1 ELISA检测试剂盒，北京勤邦生物技术有限公司；黄曲霉毒素B1标准品，纯度≥99%，美国Sigma公司；抗体工作液，酶标二抗，底物A液和B液，终止液，PBST洗液；乙腈、乙酸乙酯、正己烷、氢氧化钠、浓盐酸、十二水合磷酸氢二钠均为分析纯，北京化学试剂公司；去离子水（自制）。

1.1.2 主要仪器 8010S匀浆机，MK3酶标仪，DSY-Ⅲ氮吹仪，2000-SBL电子天平，KS-I1振荡器，Anke GL-20G-lI高速离心机，QL-901漩涡混合器，微量移液器（单道20～200 μL、100～1 000 μL，多道250 μL ）：Anglent 1200高效液相色谱仪。

1.2 检测方法的建立

1.2.1 加样方式的确定

1）分别向板孔中加入标准品溶液、样品溶液，用常规抗体稀释液稀释1∶2×104的抗体和用常规酶标二抗稀释液稀释1∶2 000的酶标二抗，振荡混匀，25 ℃避光反应30 min，用PBST洗液洗板3次。

2）加入底物A液和B液各50 μL，25 ℃反应20 min，加入50 μL终止液终止反应。

3）分别测定零标准品OD值、谷物样本OD值、0.36 μg/kg谷物OD值、0.18 μg/L标准品OD值，以零标准OD值为1.5～2.0、谷物样本OD值与零标准品OD值偏差小、0.36 μg/kg阳性谷物样品的OD值与0.18 μg/L标准品OD值偏差小、0.18 μg/L标准品OD值相对较小为判定标准，确定较好的加样方式。

1.2.2 反应温度的确定

1）向板孔中加入标准品、样品溶液50 μL，用常规抗体稀释液稀释1∶2×104的抗体50 μL和用常规酶标二抗稀释液稀释1∶2 000的酶标二抗50 μL，振荡混匀，4、25 ℃下避光反应30 min，用PBST洗液洗板3次。

2）加入底物A液和B液各50 μL，25 ℃反应20 min，加入50 μL终止液终止反应。

3）分别测定零标准品OD值、0.02 μg/L标准品OD值、谷物样本OD值，计算抑制率，以零标准品OD值为1.5～2.0，谷物样本OD值接近零标准品OD值，抑制率在70%～80%为判定标准，选择较好的反应温度。

1.2.3 抗原、抗体、酶标二抗反应时间的确定

1）向板孔中加入标准品溶液50 μL、用常规抗体稀释液稀释1∶2×104的抗体50 μL和用常规酶标二抗稀释液稀释1∶2 000的酶标二抗50 μL，振荡混匀，25 ℃下避光反应15、30、60 min，用PBST洗液洗板3次。

2）加入底物A液和B液各50 μL，25 ℃反应20 min，加入50 μL终止液终止反应；

3）测定零标准品OD值，重复3次，每次做6个对照孔，计算不同反应时间测定值的变异度CV（%）。

1.2.4 标准曲线的绘制

1）根据上述选定的加样方式、反应温度、反应时间为分析条件，用0、0.02、0.06、0.18、0.54、1.62 μg/L浓度的标准溶液进行ELISA检测，测定OD值。

2）以黄曲霉毒素B1浓度为横坐标，各对应浓度的抑制率（%）为纵坐标，制作标准曲线，计算回归方程及相关系数，根据线性方程计算IC50。

以优化的ELISA条件，对所有浓度的标准溶液进行测定，每个浓度设置3次重复，根据测定结果制作标准曲线，测定零标准品OD值、IC50、变异系数、R2、0.02 μg/L标准品抑制率及对空白谷物样本添加0.36 μg/kg的回收率。

1.3 样本前处理

1.3.1 食用油样本 吸取200 μL样本至2 mL聚苯乙烯离心管中；加入1 mL复溶工作溶液，加入0.5 mL正己烷，振荡5 min，室温离心5 min；除去上层正己烷相，取下层50 μL用于分析。

1.3.2 谷物、花生样本 用均质器均质样本；称取（2.0±0.05） g样本至50 mL聚苯乙烯离心管中；加入3.0 mL乙腈，再加入3.0 mL去离子水，振荡5 min，室温离心5 min；移取3.0 mL上层清液至50 mL聚苯乙烯离心管中，加入4.5 mL三氯甲烷，振荡5 min，室温离心5 min；去除上层液体，取3 mL下层有机相至10 mL干净玻璃试管中，于50～60 ℃水浴氮气流下吹干；加入1 mL正己烷，涡动30 s溶解干燥残留物，加入1 mL复溶工作液，用涡旋仪涡动30 s，室温离心5 min；除去上层正己烷相，取下层水相50 μL用于分析。

1.4 ELISA检测试剂盒技术参数的确定

1.4.1 试剂盒灵敏度的确定 分别测定3个批次试剂盒标准曲线的IC50抑制浓度，确定该值浮动范围。检测限（LOD）计算公式如下：

LOD=X+3×■

式中，X为重复测定空白样品的平均值，n为样品数量。

1.4.2 试剂盒特异性的测定 选择与黄曲霉毒素B1类似结构的3种物质，将不同浓度的黄曲霉毒素B1类似物，替代黄曲霉毒素B1标准溶液，测定其标准曲线，并计算IC50抑制浓度，计算交叉反应率。

交叉反应率=

■×100%

1.4.3 试剂盒精密度和准确度的测定 取食用油样品分别添加100、200和400 ng/L黄曲霉毒素B1，取花生样品分别添加200、400和800 ng/kg黄曲霉毒素B1，取谷物样品分别添加50、100和200 ng/kg黄曲霉毒素B1，每种样品、每个浓度各6次重复，用试剂盒提供的操作方法提取测定。抽取3批试剂盒，每批试剂盒测定同一份样品2次，分别计算测定样品的回收率及批内、批间变异系数。

随机抽取花生、谷物样本各20份，分别用本试剂盒方法和仪器方法进行检测。仪器方法参考文献[9]中的第三法高效液相色谱法（对花生、谷物中黄曲霉毒素B1的检出限为0.5 μg/kg）。

将制备好的试剂盒保存于2～8 ℃环境下，分别在8个时间段（第0、1、2、3、6、9、12、15月）取出做保存试验，测定其IC50，添加100、200、400 ng/L食用油的回收率，添加200、400、800 ng/kg花生的回收率，添加50、100、200 ng/kg谷物的回收率；并将试剂盒保存于37 ℃和-20 ℃环境中，在4个时间段（第0、3、6、9天）取出做加速和冻融试验。

2 结果与分析

2.1 加样方式的确定

由表1可知，当加入50 μL标准品溶液、50 μL抗体工作液、50 μL酶标二抗进行反应时，零标准品OD值在1.5～2.0之间，谷物样本OD值与零标准品OD值偏差较小，0.36 μg/kg阳性谷物样品的OD值与0.18 μg/L标准品OD值偏差较小，故该方式为较好的加样方式。

2.2 反应温度的确定

由表2可知，加入50 μL标准品溶液、50 μL抗体工作液、50 μL酶标二抗于25 ℃下避光反应，测定的零标准品OD值在1.5～2.0之间，0.02 μg/L标准品的抑制率在70%～80%之间，谷物样品的OD值与零标准品OD值偏差较小，故选择反应温度为25 ℃。

2.3 反应时间的确定

由表3可知，加入标准品50 μL、抗体50 μL、酶标二抗50 μL，25 ℃反应30 min，零标准品OD值均在1.5～2.0，且变异相对较小，故反应时间确定为30 min。

2.4 标准曲线的绘制

以优化的ELISA条件，对所有浓度的标准溶液进行测定，每个浓度设置3次重复，试验结果见表4和图1。

2.5 试剂盒灵敏度的确定

由表5结果可知，黄曲霉毒素B1 ELISA检测试剂盒标准曲线IC50的波动范围为47.5～63.1 ng/L。

对阴性食用油、花生、谷物样品进行20次检测，测定结果的平均值加上3倍标准差即为试剂盒检测实际样品的最低检测限，结果见表6。由表6可以看出，本试剂盒对食用油的最低检测限为88.82 ng/L，对花生的最低检测限为176.56 ng/kg，对谷物的最低检测限为48.51 ng/kg。

2.6 试剂盒特异性的测定

试验测得与黄曲霉毒素B1结构相似的3种物质黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2的交叉反应率分别为81.3%、62%、22.3%。

2.7 试剂盒精密度和准确度的测定

对食用油样品分别添加100、200和400 ng/L 3个浓度的黄曲霉毒素B1，样品回收率为66.5%～93.2%；对花生样品分别添加200、400和800 ng/kg 3个浓度的黄曲霉毒素B1，样品回收率为66.6%～93.0%；对谷物样品分别添加50、100和200 ng/kg 3个浓度的黄曲霉毒素B1，样品回收率为65.8%～93.8%。批内和批间变异系数均小于15%。

2.8 与仪器方法的比较

以0.5 μg/kg为阳性判定线，低于阳性判定线的值，检测结果以“—”表示，高于或等于阳性判定线的值以实际检测结果表示（表7）。由表7可以看出，试剂盒检测结果与仪器检测结果相吻合。

2.9 试剂盒的稳定性

从表8中可看出，将试剂盒保存在2～8 ℃条件下，各样品的阳性回收率都较高，可以一直保存12个月；在37 ℃和-20 ℃条件下保存时间都较短。

3 结论

本研究制备了黄曲霉毒素B1 ELISA快速检测试剂盒，得出了制备该试剂盒的最佳条件，以食用油、谷物、花生为样本，验证了该检测试剂盒的检测效果，并将其检测结果与HPLC检测结果做了对照。结果表明，在25 ℃条件下加入50 μL标准品溶液、50 μL抗体工作液、50 μL酶标二抗反应30 min变异性最小；ELISA试剂盒检测灵敏度高，对食用油、谷物、花生样品中黄曲霉毒素B1最低检测限分别为88.82 ng/L和48.51、176.56 ng/kg；平均回收率和变异系数符合相关规定；与高效液相色谱法相比，检测结果一致。ELISA试剂盒耗时短，样品前处理方法简单、检测设备投资少、成本低，能够满足批量产品中黄曲霉毒素的快速检测。

参考文献：

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[8] 陈 玲.ELISA法检测黄曲霉毒素的关键控制点[J].广东饲料，2008，17（11）：35-36.

[9] GB/T 5009.23-2006，食品中黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2的测定[S].

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