【摘要】 目的 探讨选择性环氧合酶-2（COX-2）抑制剂NS-398作用于食管癌细胞株ECa-109，观察其放射增敏作用，并对其可能增敏机制进行初步探讨。方法 应用MTT法检测NS-398对细胞的生长抑制率；克隆形成实验分析放射增敏效应，流式细胞术（FCM）定量检测细胞凋亡；实时荧光定量PCR检测凋亡相关基因Bcl-2及BaxmRNA表达。结果 NS-398可显著增强ECa-109细胞的放射敏感性，对细胞的生长抑制作用呈时间与剂量依赖性；Ns-398显著增加放射诱导的细胞凋亡，上调BaxmRNA表达，而Bcl-2表达无明显变化（P>0.05）。结论 NS-398可增强食管癌细胞ECa-109的放射敏感性，其机制可能与上调Bax表达，上升Bax/Bcl-2比例，激活线粒体凋亡通路，诱导细胞凋亡相关。
【关键词】 环氧合酶-2抑制剂；辐射增敏；细胞凋亡；食管癌细胞
食管癌是一种常见的消化道肿瘤，放射治疗为其主要治疗手段之一，目前放疗效果尚不尽人意。放射增敏剂作为提高放疗效果的一个重要途径，也已成为研究热点。新近发现诱导型环氧合酶-2（Cyclooxygenase-2，COX-2）抑制剂在体内外都有放射增敏作用[1-2]，然其确切增敏机制尚未明确。本研究探讨COX-2抑制剂NS-398对食管癌细胞系ECa-109的放射敏感性影响，并初步研究其可能增敏机制。
1 资料与方法
1.1 一般资料 RPMI1640培养基、胰蛋白酶购自美国GIBCO公司；胎牛血清为杭州四季青产品；MTT、DMSO、NS-398均为Sigma产品；NS-398溶于DMSO中，现配现用。Trizol为Invitrogen公司产品；RevertAid first strand cDNA Synthesis试剂盒为MBI产品；PCR试剂盒购自大连宝生物公司；引物为上海伯亚公司合成；Annexin V-FITC Kit购自Immunotech Company（France）。Caspase-3Colorimetric Assay Kit系BioVision（USA）产品；PMD18-T Vector购自TaKaRa Company。Epics-XLⅡ型流式细胞仪（Beckman-Coulter Company，USA）；食管癌细胞株ECa-109为浙江大学医学院附属邵逸夫医院中心实验室保存。
1.2 细胞培养 将ECa-109细胞接种于含双抗的10%胎牛血清RPMI1640培养基中，37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。实验选取对数生长期细胞。
1.3 MTT实验检测药物毒性及适宜浓度 将细胞以105/孔接种96孔板，24h后开始药物实验，NS-398设0、10、50、100μmol/L4个浓度组，每个浓度组各取12、24、48、72h四个时间点检测，设不接种细胞的空白对照和只含1‰DMSO的对照，每浓度每时间点重复4孔。采用MTT法在酶联免疫检测仪上测定570nm处吸光度值（A），细胞存活率（%）=实验孔A值/对照孔A值×100%。
1.4 克隆形成实验分析放射增敏效应 实验分组：①单照组；②联合组：照射+NS-398处理。根据不同照射剂量接种适量细胞于培养皿，24h贴壁，联合组更换含25μmol/L的NS-398培养液，两组继续培养24h，室温下分别接受0、2、4、6、8、10Gy的6MVX-ray照射，照射后联合组更换无药培养液，两组继续培养14天。甲醇固定，姬姆萨染色，计数>50个细胞克隆数。经单纯用药校正后计算存活分数，实验结果3次平均值。以多靶单击数学模型拟合细胞存活曲线，计算参数D0、Dq及SER（放射增敏比）值。
1.5 FCM检测细胞凋亡 实验分4组：①未处理组；②单药组：含25μmol/LNS-398培养液培养24h；③单照组：6MVX线照射8Gy，SAD为100cm，机架角为180°，加1.5cm等效组织填充物，剂量率1Gy/min；④联合组：照射+药物。各组取处理后细胞1×106个，按AnnexinV-FITCkit说明书步骤，加PI染液5μL，Annexin V-FITC染液5μL，室温、避光培育30min，加入900μL Binding Buffer，上机检测，由FS和SS设门选定细胞，利用Coulter公司的System II TM软件处理结果，每次实验均设阴性和阳性对照，并设3复孔。
1.6 实时荧光定量PCR检测Bcl-2、BaxmRNA表达 PCR引物用primer5.0软件设计，并经GenBank校对，核实。Bcl-2引物：正义链5′-GCCTTCTTTGAGTTCGG-3′，反义链5′-GGGTGATGCAAGCTCC-3′.Bax引物：正义链5′-GCATCGGGGACGAACTGG-3′，反义链5′-GTCCCAAAGTAGGAGAGGA-3′；B-actin引物：正义链5′-TCCTCCTGAGCGCAAGTACTCT-3′，反义链5′-GCTCAGTAACAGTCCGCCTAGA-3′。样本检测：4组细胞（分组同上）总RNA抽提，逆转录成cDNA备用。采用SYBR Green I PCR试剂（Perkin-Elmer Applied Biosystems）在LightCycler（Roche）上进行实时荧光定量PCR反应。反应体系2OμL：10×PCR buffer 2μL，25mmol/LMg2+2μL，10μmmol/LdNTPs0.5μL，25mmol/L上下游引物各0.25μL，cDNA模板1μL，5×106U/LTaq酶0.25μL。20×SYBR Green 10.5μL，ddH2O13.25μL。反应条件：①95°C60s；②循环40次：95°C6s，52°C9s，72°C24s；③95°C9s，60°C60s，95°C9s。外加1个PCR反应液孔为空白对照，每样品3复孔，保证实验数据的有效性。PCR结束后，分析各孔ct值（ct值随模板浓度的增大而减小，和mRNA表达水平相反），以B-actin为内参照，计算dCt值（其值越大，起始拷贝数越少，即模板浓度越低）：dCt值=样本原始Ct值-样本B-actin的Ct值。
1.7 统计学方法 应用SPSS15.0统计软件作方差分析，如有差异，多组间参数两两比较采用q检验。
2 结 果
2.1 NS-398对ECa-109细胞生长的影响 MTT法测定结果显示，NS-398对ECa-109细胞有明显的抑制生长作用，并呈时间和剂量依赖性（F=15.01，6.339，P<0.001）。24小时其细胞存活率最高为86.97%（25μmol/L），最低为54.20%（200μmol/L），IC50为253.5μmol/L。为尽量避免药物本身对细胞的毒性作用，在随后的实验中NS-398都采用25μmol/L浓度。
2.2 NS-398的放射增敏作用 NS-398可显著增加ECa-109细胞的放射敏感性，见图1。单照组和联合组的D0值分别1.74、1.35Gy；Dq值分别为2.46、1.86Gy；SER为1.30。
2.3 NS-398诱导凋亡 FCM显示单药组和单照组的凋亡率分别为（3.65±0.55）%和（4.64±0.63）%，较未处理组（1.47±0.39）%均有增加（P<0.01），而联合组的凋亡率（10.90±0.93）%明显高于单照组和单药组（P<0.01），见图2。且联合组细胞死亡率明显高于其他组。
2.4 四组细胞Bcl-2 mRNA及Bax mRNA表达 见表1、BaxdCt值单处理组显著低于未处理组（P<0.05），而联合组显著低于单处理组（P<0.05）。基因表达量与dCt值相反，即NS-398和照射均可上调Bax mRNA表达，两者联合进一步上调。4组bcl-2 mRNA的表达差异尚无显著（P<0.05），见表1。
表1 ECa-109细胞Bcl-
3 讨 论
COX-2是近年来国内外研究的热点，在许多肿瘤中高表达，推测与肿瘤的发生、发展、转移密切相关。抑制COX-2的表达和（或）对抗COX-2的活性可以阻滞COX-2的促癌作用[3-4]。已有研究证实COX-2抑制剂具有抑制肿瘤生长的作用，分析其机制为抑制肿瘤血管生成、诱导癌细胞凋亡等[5]。研究还发现COX-2抑制剂能增强肿瘤的放射敏感性[6]，其具体增敏机制目前尚无定论，可能与下调COX-2表达，从而降低细胞内PGE2水平[7]；抑制细胞增殖和促进凋亡[8]；诱导细胞周期的阻滞[9]；抑制放射引起DNA损伤的修复[10]；抑制肿瘤血管生成[11-12]等相关。本研究发现COX-2选择性抑制剂NS-398能显著增强食管癌细胞株ECa-109的放射敏感性。
本研究流式细胞术（FCM）分析细胞凋亡的结果表明，COX-2抑制剂NS-398本身能诱导肿瘤细胞ECa-109凋亡，也能增加放射诱导的凋亡。Pyo等[13]亦报道NS-398诱导肺癌H460细胞凋亡的同时增加放射诱导的凋亡。而Raju[14]报道COX-2抑制剂SC-236本身能诱导肿瘤细胞NFSA凋亡，但不能增加放射诱导的凋亡；也有报道COX-2抑制剂celecoxib既不诱导肺癌A549细胞凋亡，也不增加放射诱导的凋亡[15]。可见COX-2抑制剂的放射增敏机制相当复杂，可能与其肿瘤细胞的类型、COX-2抑制剂的分类及其他未知因素相关。
凋亡相关信号转导通路主要有两条：内源性通路即线粒体通路和外源性通路即死亡受体通路。Bcl-2家族对线粒体通路的调控具举足轻重的地位。该家族分抗凋亡基因如Bcl-2、Bcl-xl等和促凋亡基因Bak、Bax等。Bcl-2和Bax是目前研究最多的一对正负调节细胞凋亡的基因，两者的比例决定了细胞的命运。研究表明，Bcl一2家族通常以二聚体形式发挥作用，Bax二聚体诱导细胞凋亡，而Bcl-2/Bax异源二聚体及Bcl-2二聚体抑制细胞凋亡。本研究通过荧光定量PCR检测发现：NS-398和放疗均可引起ECa-109Bax表达上调，从而使Bax/Bcl-2的比值上升。两者联合则具协同效应，使Bax表达进一步上调。
综上所述，NS-398能增强食管癌细胞株ECa-109对放射的敏感性，其增敏机制可能与诱导细胞凋亡增加有关。上调Bax表达，增加Bax/Bcl-2比例，激活线粒体凋亡通路，最终诱导细胞凋亡可能为其机制之一，更为确切的机制有待进一步研究。
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