[摘要] 目的 探讨妇科恶性肿瘤腹腔镜术建立CO2气腹过程中的腹膜免疫因子变迁机制。 方法 选取广州医科大学附属肿瘤医院妇科恶性肿瘤患者64例。根据手术方式将其分为两组，观察组34例，行腹腔镜术；对照组30例，行传统开腹手术。采用流式细胞术测定术前术后外周血CD4+T淋巴细胞、NK细胞及CD4+CD25highCD127lowTreg水平；采用ELISA法检测术后腹膜免疫因子IL-6、TNF-β、TNF-α水平。 结果 经建立CO2气腹的腹腔镜术后1 d观察组患者外周血CD4+T 淋巴细胞、NK细胞水平显著低于对照组，而CD4+CD25highCD127lowTreg细胞水平显著高于对照组（P < 0.05）；但术前1 d及术后1周，两组患者的外周血CD4+T淋巴细胞、NK细胞及CD4+CD25highCD127lowTreg细胞水平比较差异无统计学意义（P > 0.05）；观察组腹膜免疫因子（IL-6、TNF-α）水平均显著低于对照组，而TNF-β水平显著高于对照组（P < 0.05）；CD4+CD25highCD127lowTreg水平与恶性肿瘤的临床分期相关，表现为Ⅱ～Ⅲ期患者显著高于Ⅰ期患者（P < 0.05）；经Pearson相关性分析发现：CD4+CD25highCD127lowTreg与IL-6、TNF-α水平呈负相关（r = -0.741、-0.695，P < 0.05）；CD4+CD25highCD127lowTreg与TNF-β呈正相关（r = 0.694，P < 0.05）。 结论 妇科恶性肿瘤腹腔镜术建立CO2气腹过程中可能通过抑制腹膜免疫因子IL-6、TNF-α水平或增加CD4+CD25highCD127lowTreg细胞水平的方式降低患者的免疫功能，随术后时间的延长患者免疫功能可恢复。
[关键词] 妇科恶性肿瘤；腹腔镜术；气腹；腹膜；免疫因子
[中图分类号] R737.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）10（b）-0004-04
Mechanism of peritoneal immune factors change during establishing CO2 pneumoperitoneum in gynecological malignant tumor laparoscopy
TANG Kaiwen
Cancer Center of Guangzhou Medical University， Guangdong Province， Guangzhou 510095， China
[Abstract] Objective To discuss the mechanism of peritoneal immune factors change during establishing CO2 pneumoperitoneum in gynecological malignant tumor laparoscopy. Methods 64 patients with malignant gynecological tumor in Cancer Center of Guangzhou Medical University were selected. According to the operation mode all patients were divided into two groups， the observation group （n = 34） was treated with laparoscopic surgery， control group （n = 30） was treated with traditional open operation. The levels of preoperative and postoperative peripheral blood CD4+T lymphocytes， NK cells and CD4+CD25highCD127lowTreg were detected by flow cytometry. ELISA method was used to detect postoperative peritoneal immune factors IL-6， TNF-β， TNF-α. Results 1 day after establishing CO2 pneumoperitoneum in gynecological malignant tumor laparoscopy， CD4+T lymphocytes， NK cells of observation group were significantly lower than those of the control group， while the level of CD4+CD25highCD127lowTreg cells was significantly higher than that of the control group （P < 0.05）； but 1 weeks after operation and 1 days before operation， the two groups had no statistically significant differences in the peripheral blood CD4+T lymphocyte， NK cells and CD4+CD25highCD127lowTreg cells level （P > 0.05）. In observation group peritoneal immune factors （IL-6， TNF-α） levels were significantly lower than those in the control group， while the level of TNF-β was significantly higher than that in the control group （P < 0.05）. Clinical CD4+CD25highCD127lowTreg level was related with clinical staging of malignant tumor， Ⅱ-Ⅲ clinical staging patients were higher than the Ⅰ clinical staging patients （P < 0.05）. Pearson correlation analysis showed that CD4+CD25highCD127lowTreg was negatively correlated with IL-6， TNF-α （r = -0.741， -0.695， P < 0.05）； CD4+CD25highCD127lowTreg and TNF-β was positively correlated （r = 0.694， P < 0.05）. Conclusion Establishing CO2 pneumoperitoneum in gynecological malignant tumor laparoscopy can decrease patients" immune function by inhibiting IL-6， TNF-α levels and increasing CD4+CD25highCD127lowTreg level， but patients" immune function can be restored with the extension of postoperative time.
[Key words] Gynecological malignant tumor； Laparoscopy； Pneumoperitoneum； Peritoneum； Immune factors
妇科恶性肿瘤腹腔镜微创手术避免了传统开腹手术后的神经功能损害与排尿功能障碍，增强了妇科恶性肿瘤的治疗效果。但研究报道显示：腹腔镜微创手术在一定程度上损害了患者的免疫功能，导致了患者抑制肿瘤的能力降低，增加了肿瘤的转移率[1]。建立CO2气腹是腹腔镜术治疗的常规手段，提高了术区的手术视野，增加了术者操作空间，是提高腹腔镜术成功率的重要保证，然而，CO2刺激作用影响了腹腔微环境、腹膜免疫因子及免疫功能[2]。本研究通过进行妇科恶性肿瘤腹腔镜术与传统开腹手术治疗后免疫因子及免疫功能的对比研究，探讨妇科恶性肿瘤腹腔镜术建立CO2气腹过程中的腹膜免疫因子变迁机制。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取广州医科大学附属肿瘤医院2010年7月～2013年7月妇科恶性肿瘤患者64例。入选标准[3]：全部患者经术前病理活检确诊妇科恶性肿瘤；排除标准：甲状腺功能亢进、甲状腺功能低下、糖尿病等代谢功能障碍性疾病，肝肾功能障碍，心脑血管疾病急性发作期，孕产妇等。全部患者根据手术方式分为两组，其中拟行腹腔镜术的患者为观察组，拟行传统开腹手术的患者为对照组。观察组34例，年龄23～56岁，平均（47.01±8.91）岁；疾病类型：子宫内膜癌17例，宫颈癌13例，卵巢癌4例；TNM分期：Ⅰ期19例，Ⅱ期14例，Ⅲ期1例。对照组30例，年龄22～56岁，平均（46.95±9.04）岁；疾病类型：子宫内膜癌14例，宫颈癌13例，卵巢癌3例；TNM分期：Ⅰ期18例，Ⅱ期11例，Ⅲ期1例。两组患者在年龄、疾病类型、TNM分期等方面比较差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。
1.2 手术方法
观察组患者术前3 d进行肠道准备与脐部清洁，术前1 d禁食。患者采用气管插管下复合麻醉方式，常规行脐孔穿刺后建立CO2气腹，在患者的右下腹、左下腹、腹直肌外侧置入配套管针，在内镜的辅助下进行全子宫切除术与附近淋巴结清扫术。对照组患者在全身麻醉下进行全子宫切除术与附近淋巴结清扫术。
1.3 观察指标
外周血CD4+T淋巴细胞、NK细胞及CD4+CD25high CD127lowTreg细胞水平，腹膜免疫因子（IL-6、TNF-β、TNF-α）水平，分析CD4+CD25highCD127lowTreg细胞与免疫因子的关系。
1.4 检测方法
①流式细胞术：术前1 d、术后1 d、术后1周清晨空腹抽取患者静脉血，采用流式细胞仪（由上海碧迪医疗器械公司提供）测定患者CD4+T淋巴细胞、NK细胞及CD4+CD25highCD127lowTreg水平，分析两组患者术前、术后的免疫功能。②两组患者术后取腹膜组织，剪成1 mm3，缓冲液反复漂洗后采用酶消化法获取细胞混悬液，采用分离液将腹膜组织与淋巴细胞分离，淋巴细胞接种于DMEM培养基并在37℃、5%CO2中常规培养7 d。采用酶联免疫吸附（ELISA）法测定免疫因子IL-6、TNF-α、TNF-β水平。ELISA免疫试剂盒由上海谷研公司提供。
1.5 统计学方法
采用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；相关性分析采用Pearson检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组外周血CD4+T 淋巴细胞、NK 细胞及CD4+CD25highCD127lowTreg细胞水平比较
术前1 d两组患者外周血CD4+T淋巴细胞、NK细胞及CD4+CD25highCD127lowTreg细胞水平比较差异无统计学意义（P > 0.05）；术后1 d观察组患者外周血CD4+T淋巴细胞、NK细胞水平显著低于对照组，两组比较差异有统计学意义（P < 0.05），观察组外周血CD4+CD25highCD127lowTreg细胞水平显著高于对照组，两组比较差异有统计学意义（P < 0.05）；术后1周，两组患者的外周血CD4+T淋巴细胞、NK细胞及调节性T细胞CD4+CD25highCD127lowTreg细胞水平比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。
表1 两组患者不同时间淋巴细胞亚群及CD4+CD25highCD127lowTreg细胞水平比较（×10-2，x±s）
注：t1为两组术前1 d比较，t2为两组术后1 d比较，t3为两组术后1周比较；*P < 0.05
2.2 两组腹膜免疫因子水平比较
观察组患者IL-6、TNF-α水平均显著低于对照组，差异有统计学意义（均P < 0.05）；观察组患者TNF-β水平显著高于对照组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。
表2 两组患者腹膜免疫因子水平比较（x±s）
注：IL-6：白细胞介素6；TNF：肿瘤坏死因子
2.3 调节性T细胞CD4+CD25highCD127lowTreg水平与临床分期及腹膜免疫因子关系
Ⅰ期恶性肿瘤患者调节性T细胞CD4+CD25highCD127lowTreg水平为（8.54±0.37）×10-2，Ⅱ～Ⅲ期患者调节性T细胞CD4+CD25highCD127lowTreg水平为（11.34±0.79）×10-2，两者比较差异有统计学意义（P < 0.05），提示调节性T细胞CD4+CD25highCD127lowTreg水平可能与临床分期相关。Pearson相关性分析显示，外周血CD4+CD25highCD127lowTreg水平与IL-6、TNF-α呈负相关（r = -0.741，-0.695，P < 0.05）；与TNF-β呈正相关（r = 0.694，P < 0.05）。
3 讨论
妇科恶性肿瘤腹腔镜术后肿瘤移植与侵袭发病机制的研究[4]发现：在建立CO2气腹过程中，CO2刺激严重影响了腹膜微环境，影响了腹膜组织的正常代谢及局部免疫功能，进而促进了肿瘤的生长与转移。腹膜是间皮细胞组成的特有黏膜结构，具有非特异性的防御功能，在防止细菌入侵及肿瘤细胞散播中发挥重要作用。临床分析妇科恶性肿瘤腹腔镜术建立CO2气腹过程中的腹膜免疫因子变迁机制及手术前后免疫功能的变化成为了妇科恶性肿瘤领域研究的热点。另外，腹膜组织中具有多种免疫因子，以白细胞介素与肿瘤坏死因子最为常见，IL-6、TNF-β、TNF-α是腹膜免疫功能的代表因子。IL-6具有促进T淋巴细胞及B淋巴细胞活化的功能，在细胞免疫应答及体液免疫过程中也具有重要作用[5]；TNF-α是细胞分泌的蛋白分子，与肿瘤表面膜受体结合后入侵细胞，释放溶酶体引起自溶[6]。免疫功能主要以T细胞介导的免疫应答作用为主，T细胞介导的免疫应答在肿瘤的发生与发展中具有重要的意义，T细胞包括MHC-Ⅰ类与MHC-Ⅱ类抗原限制性T淋巴细胞。调节性T细胞是具有负调控功能的特殊性T淋巴细胞群，研究发现调节性T细胞的表面标志分子很多，但近年来CD4+CD25highCD127lowTreg被认为是最具特异性的细胞表面标志分子[7]。调节性T细胞具有维持患者机体自身免疫功能的稳定，且在自身免疫性疾病的预防中具有关键性作用。但调节性T细胞对肿瘤患者的免疫功能具有抵抗作用，明显降低肿瘤的临床治疗效果。研究发现，肝硬化活动期患者外周血CD4+CD25highCD127lowTreg水平显著高于稳定期患者，经治疗后可明显降低[8]。恶性肿瘤患者外周血CD4+CD25highCD127lowTreg水平显著高于子宫肌瘤患者，经治疗后其水平明显下降。调节性T细胞可能通过抑制NK细胞数目及免疫因子IL-6、TNF-α分泌水平及上调TNF-β分泌水平来达到降低肿瘤患者免疫功能、促进肿瘤生长的目的。CO2进入腹腔后，对腹腔微环境的pH产生严重影响，使之腹腔微环境成为强酸性环境，免疫因子分泌受阻，因而，腹腔镜术建立CO2气腹过程中由于CO2刺激降低了分泌型免疫因子IL-6、TNF-α的分泌，另外，CO2气腹的形成增加了机械性压迫，影响了患者术后肿瘤的转移与侵袭[9-10]。因此，妇科恶性肿瘤腹腔镜术建立CO2气腹过程中的腹膜免疫因子变迁机制主要是因为CO2刺激改变了腹腔微环境及CO2气压压迫性影响了肿瘤的转移，进一步损害了患者的免疫功能。
本研究显示：经建立CO2气腹的腹腔镜术后1 d患者外周血CD4+T淋巴细胞、NK细胞、腹膜免疫因子（IL-6、TNF-α）水平显著低于传统开腹手术，而调节性T细胞、TNF-β水平显著高于传统开腹手术，但术前1 d及术后1周，两组患者的外周血CD4+T淋巴细胞、NK细胞及CD4+CD25highCD127lowTreg细胞水平比较差异无统计学意义；调节性T细胞水平与恶性肿瘤的临床分期相关，表现为Ⅱ～Ⅲ期显著高于Ⅰ期患者（P < 0.05）；经Pearson相关性分析发现，CD4+CD25highCD127lowTreg与IL-6、TNF-α呈负相关，CD4+CD25highCD127lowTreg与TNF-β呈正相关（P < 0.05）。免疫因子与患者的免疫功能紧密相关，免疫因子可能与妇科肿瘤形成有关，腹腔组织分泌的免疫因子具有抑制肿瘤生长的作用，但是在腹腔微创手术CO2气腹过程中腹膜免疫因子与腹腔微环境的酸碱度、温度、形成的充气气压明显相关[11]。本研究发现，受CO2气腹的影响，免疫因子IL-6、TNF-α浓度明显降低；调节性T细胞CD4+CD25highCD127lowTreg与恶性肿瘤患者的临床分期相关，TNM分期越高，其水平越高，免疫功能越低；而TNF-β浓度及调节性T细胞CD4+CD25highCD127lowTreg水平升高的原因尚需进一步临床探讨。
妇科恶性肿瘤腹腔镜术建立CO2气腹过程中可能通过抑制腹膜免疫因子IL-6、TNF-α水平或增加TNF-β、CD4+CD25highCD127lowTreg细胞水平的方式降低患者的免疫功能，随术后时间的延长患者免疫功能可恢复。
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（收稿日期：2014-07-03 本文编辑：程 铭）
