[摘要] 目的 探讨急性甲胺磷农药中毒早期血药浓度与T淋巴细胞亚群的关系。 方法 选择2007年1月~2013年6月河北大学附属医院急诊医学科92例口服急性甲胺磷农药中毒患者为研究对象，根据中毒程度分为轻中度中毒组54例和重度中毒组38例，另选同期健康体检者92例为对照组，检测并分析两组患者血药浓度与CD3+、CD95+、CD3+/CD23+、CD8+/CD28+、CD8+/CD28-的关系。 结果 重度中毒组血药浓度[（2.13±0.32）μmol/L]明显高于轻中度中毒组[（1.35±0.18）μmol/L]，差异有高度统计学意义（P < 0.01）；重度中毒组CD95+、CD3+/CD23+、CD8+/CD28+明显高于轻中度中毒组（q = 6.71、6.48、6.48，均P < 0.01）；重度中毒组CD3+、CD8+/CD28-明显低于轻中度中毒组（q = 6.75、6.54，P < 0.05或P < 0.01）。 结论 急性甲胺磷农药中毒早期血药浓度越高，中毒程度愈重，免疫细胞受损越严重。
[关键词] 甲胺磷；血药浓度；免疫学指标
[中图分类号] R139.3[文献标识码] B[文章编号] 1673-7210（2014）06（c）-0143-04
The relationship between early blood drug concentration and biochemical and CD molecular and clinical significance in patients with acute organophosphorus pesticide poisoning
YANG Weihong PENG Guangjun WANG Xinping CHANG Haizhe CAO Guohui JIA Xuemei
Department of Emergency Medicine, the Affiliated Hospital of Hebei Univercity, Hebei Province, Baoding 071000, China
[Abstract] Objective To study the relationship between blood drug concentration and T lymphocyte subsets in early stage of acute Methamidophos poisoning. Methods 92 cases with acute oral Methamidophos pesticide poisoning from January 2007 to June 2013 in the Department of Emergency Medicine, Affiliated Hospital of Hebei University were selected as study objects, and they were divided into mild-to-moderate poisoning group (n = 54) and severe poisoning group (n = 38) according to the degree of intoxication, another 92 healthy control in the same term were selected as control group, The relationship between the two groups of blood drug concentration and CD3+, CD95+, CD3+/CD23+, CD8+/CD28+, CD8+/CD28- were analyzed. Results The concentration of blood drug level of severe poisoning group [(2.13±0.32) μmol/L] was significantly higher than that of the mild-to-moderate poisoning group [(1.35±0.18) μmol/L], the difference was statistically significant (P < 0.01); the level of CD3+, CD95+, CD3+/CD23+, CD8+/CD28+, CD8+/CD28- of severe poisoning groupwere higher than those of the mild-to-moderate poisoning group (q = 6.71, 6.48, 6.48; all P < 0.01); the level of CD3+and CD8+/CD28- of severe poisoning group were lower than those of the mild-to-moderate poisoning group (q = 6.75, 6.54，P < 0.05 or P < 0.01). Conclusion The higher of the acute Methamidophos pesticide poisoning early blood drug concentration, the more serious of the poisoning degree and the immune cellular damage.
[Key words] Methamidophos; Blood drug concentration; Immunology index
中国是个农业大国，随着有机磷农药在农业生产中的广泛使用，急性有机磷农药中毒（acute organic phosphorus poisoning，AOPP）患者逐年增多，严重危害人们的身体健康。急性甲胺磷农药中毒可引起机体多脏器功能损害及多种生化指标的改变，同时还可伴有免疫功能减退。T淋巴细胞是机体免疫系统内功能最重要的细胞群，检测T淋巴细胞是观察机体免疫的重要方法之一。AOPP患者外周血T淋巴细胞亚群的变化已有少量文献介绍[1]。为了探讨血药浓度与人体生化及免疫学指标的关系，本研究对92例急性甲胺磷农药中毒患者的血药浓度、T淋巴细胞亚群进行了检测，并分析其相关性及临床意义。
1资料与方法
1.1 一般资料
选择2007年1月~2013年6月河北大学附属医院（以下简称“我院”）急诊医学科收治的甲胺磷农药中毒（均为口服农药）患者92例为研究对象，其中男37例，女55例，年龄36~49岁，平均（40.21±10.25）岁。将所有患者根据中毒程度，分为轻中度中毒组（n = 54）和重度中毒组（n = 38）。轻中度中毒组中，男20例，女34例，年龄36~48岁，平均（38.52±10.87）岁；重度中毒组中，男17例，女21例，年龄37~48岁，平均（39.85±6.26）岁。选择同期我院门诊健康体检者92名为对照组，其中男38例，女54例，年龄35~50岁，平均（40.21±10.25）岁。三组均排除心、肺、肾脏疾病、自身免疫病、免疫缺陷病、超敏反应性疾病，且未使用过免疫抑制剂史，两组性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。
1.2 诊断标准
急性甲胺磷农药中毒的诊断符合以下标准[2]：①有暴露史；②相关中毒症状及体征，特别是呼出气大蒜味、瞳孔缩小、多汗、肺水肿、肌纤维颤动和昏迷的患者；③全血胆碱酯酶（ChE）活性降低有不同程度降低；④血、胃内容物检测有机磷农药及代谢物。
1.3 中毒程度分级
临床中毒程度分级标准[2]：①轻度中毒：仅有毒蕈碱样症状，ChE活力50%~70%；②中度中毒：毒蕈碱样症状加重，出现烟碱样症状，ChE活力30%~<50%；③重度中毒：具有毒蕈碱样症状和烟碱样症状，并伴有肺水肿、抽搐、昏迷、呼吸肌麻痹和脑水肿，ChE活力<30%。
1.4 观察指标
检测三组CD3+、CD95+、CD3+/CD23+、CD8+/CD28+、CD8+/CD28-水平，并检测轻中、重度中毒组患者的血药浓度。
1.5 检测及治疗方法
CD3+、CD95+、CD3+/CD23+、CD8+/CD28+、CD8+/CD28-检测：抽取肘静脉血2 mL，采用EDTA-Na2抗凝后，取100 μL抗凝全血，分别加入抗CD3+、CD95+、CD3+/CD23+、CD8+/CD28+、CD8+/CD28-荧光抗体各20 μL（法国Immunotech公司生产），对淋巴细胞作标记并且混匀，避光、在室温下放置15 min，再分别加入0.12%甲酸及1%多聚甲醛进行固定，完成溶解红细胞及固定15 min（美国Coulter公司，CoaHem型Q-PREP机），稳定20 min后每100微升血样采用流式细胞仪（Beckman公司，型号为ESPIL-XL）检测1×104个淋巴细胞，对被荧光单抗标记的抗原阳性的细胞计数，以百分率表示。
血药浓度检测：每例取肘静脉血清0.5 mL置于10 mL具塞比色管中，然后加入丙酮2.0 mL，混匀2.0 min在混匀器上，置于离心机上3000 r/min离心10 min，取其上清液，合并萃取液，用丙酮定容至4.0 mL并摇匀，遂用气相色谱仪分析（美国安捷伦公司，型号Agilent 7890A）。经过丙酮萃取以后，采用火焰光度气相色谱法测定甲胺磷农药含量。
重度中毒组患者入院后立即给予常规洗胃，常规氯磷定、阿托品等治疗。
1.6 统计学方法
采用SPSS 10.1统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组患者血药浓度比较
重度中毒组血药浓度明显高于轻中度中毒组，两组比较差异有高度统计学意义（P < 0.01）。见表1。
表1 3组血药浓度比较（μmol/L，x±s）
2.2 三组各T淋巴细胞亚群水平比较
单因素方差分析结果显示，三组CD95+、CD3+/CD23+、CD8+/CD28+、CD8+/CD28-水平比较差异均有高度统计学意义（P < 0.01），其中CD95+、CD3+/CD23+、CD8+/CD28+、CD8+/CD28-于三组间重度中毒组>轻中度中毒组>对照组；三组CD3+水平比较，差异有统计学意义（P < 0.05），且重度中毒<轻中度中毒<对照组。见表2。
SNK-q检验分析结果显示，重度中毒组CD95+、CD3+/CD23+、CD8+/CD28+明显高于轻中度中毒组（q = 6.71、6.48、6.48；均P < 0.01）；重度中毒组CD3+、CD8+/CD28-明显低于轻中度中毒组（q = 6.75、6.54，P < 0.05或P < 0.01）。见表2。
3讨论
急性甲胺磷农药中毒发病机制是农药吸收到入体内，ChE活性受到抑制而下降，ChE不能分解乙酰胆碱，在体内蓄积了大量乙酰胆碱，出现一系列中毒症状[3]。但对中毒后的机体免疫功能，尤其是T淋巴细胞免疫功能的报道很少，及其与病情轻重的关系，与血药浓度的关系未见报道。AOPP是一种以有机磷毒物与机体内胆碱酯酶结合，继而引起全身病理生理变化的疾病。部分资料显示，有机磷农药中毒最初可导致各个实质脏器的病理生理变化，继而会导致T淋巴细胞免疫系统功能的减退[4]。了解血药浓度与生化及免疫学指标的相关性，对AOPP的病情判断、合理指导综合治疗是至关重要的。
免疫的防御感染、自我稳定、免疫监视功能会维持机体内环境平衡与稳定。T淋巴细胞是机体免疫细胞的重要部分，分为许多不同的亚群，不同的亚群临床作用不同，在正常人体中相互作用，使机体的免疫功能得以正常维持[5]。当各T淋巴细胞亚群在数量上发生变化，功能上也发生异常时，机体免疫功能发生紊乱，继而出现一系列病理生理变化[6]。
本研究通过对重度中毒组、轻中度中毒组的血药浓度进行比较，发现重度中毒组明显高于轻中度中毒组，提示，血药浓度能在一定程度上反映中毒程度。CD3+是成熟总T细胞的标志之一，本研究还发现急性甲胺磷中毒患者CD3+的水平重度中毒<轻中度中毒<对照组。CD3+与TCR组成T细胞膜受体复合物[7]。CD3+下降表明成熟总T细胞总数减少，原因可能是急性甲胺磷农药中毒患者T细胞凋亡增加，是T细胞与疾病作斗争的结果，使机体避免遭受过强的免疫反应，使其免于继发性损伤[8]。同时急性甲胺磷中毒患者外周血CD8+/CD28-T细胞降低。且血药浓度愈高，CD8+/CD28-T细胞下降愈明显，且重度中毒组<轻中度中毒组<对照组；与此同时，CD95+（Fas）表达水平的比较显示，轻中度中毒组患者Fas表达水平明显高于对照组，而重度中毒组与轻中度中毒组亦有明显增高。血药浓度愈高，Fas表达水平愈高，并且重度中毒组>轻中度中毒组>对照组。淋巴细胞的产生与凋亡的动态平衡使正常人机体的免疫功能得以正常维持。急性甲胺磷农药中毒时，被破坏的平衡激活了T细胞，使得在T淋巴细胞凋亡中起着重要作用的T细胞Fas得以高度表达，当Fas与FasL结合时，FasL向细胞内发送“死亡信号”，并启动了死亡结构域相关蛋白（FADD）及天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白水解酶家族，致使T细胞在数小时内引起大量凋亡[9]。从而使活化的T细胞数量减少。一方面可以使过强的免疫反应对机体造成损伤，另一方面导致了机体的免疫功能低下。综上所述，提示急性甲胺磷农药中毒患者外周血T细胞通过Fas/FasL途径凋亡增加，且与血药浓度呈正相关。表明急性甲胺磷农药中毒患者细胞免疫功能不正常。
机体免疫一种内稳状态的维持依赖于CD8+T细胞的细胞增生和细胞转换[10]。急性甲胺磷农药中毒后患者CD8+T细胞及其亚群的明显消亡使得CD8+T细胞免疫储备量迅速减少，不能充分接触抗原发生免疫应答[11]。急性甲胺磷中毒患者CD8+/CD28+较正常人高，重度中毒组高于轻中度中毒组，且随着血药浓度越高，CD8+/CD28-降低愈显著。根据CD28的表达与否，CD8+T细胞分为抑制性T细胞（CD8+/CD28-）及细胞毒T细胞（CD8+/CD28+），CD8+/CD28+即杀伤效应细胞，可以溶解靶细胞还可诱导细胞的凋亡，而CD8+/CD28-即免疫调节细胞，可以产生许多细胞因子对CD28表达其调节作用；CD8+/CD28-T细胞的增加和CD8+/CD28+T细胞的缺失是T细胞功能下降的主要标志[12]。
综上所述，本研究提示，急性甲胺磷农药中毒患者中毒后T淋巴细胞各亚群变化与血药浓度及中毒程度密切相关，血药浓度高，中毒程度越重，T淋巴细胞功能的下降愈明显，患者细胞免疫功能低下或失衡，免疫失衡加速病情的进展，感染的发生概率增加，甚至发生多脏器功能衰竭，无疑增加了治疗难度[13-16]。因此，临床上AOPP患者细胞免疫功能低下与中毒剂量、病情严重程度有关，治疗上除了胆碱酯酶复能剂与阿托品外，早期应注意毒物的清除，减少毒物吸收，也应注意免疫功能的调节与改善，以便提高患者的治愈率。
[参考文献]
[1]陆再英，钟南山.内科学[M].北京：人民卫生出版社，2001：1139-1143.
[2]叶任高.内科学[M].5版.北京：人民卫生出版社，2002：956-957.
[3]彭树楠.有机磷中毒抢救治疗与管理[M].北京：群众出版社，1990：64-65.
[4]刘林修，刘思管，程文伟，等.血清单核细胞趋化蛋白-1在急性有机磷农药中毒中的表达及临床意义[J].中国急救医学，2011，31（1）：69-70.
[5]Lamonier NM，Arron M，Zeng Y，et al. Tumor-derived CD4+，CD23+ regulatory cell suppression of dendritic cellfunction involves TGF-β and IL-10 [J]. Cacer Immunology Immunotherapy，2007，56（1）：48.
[6]周亚新，钱传忠.病毒性脑炎患者外周血T淋巴细胞亚群及NK细胞变化的临床研究[J].实用临床医药杂志，2008， （3）：82-83.
[7]Ganse WG，Ekkens M，Nguyen D，et al. The development of CD4+ T effector cells during the type 2 immune [J]. Immunol Res，1999，20：55-65.
[8]高越，何建如，许国根，等.急性有机磷农药中毒患者外周血淋巴细胞CD分子的变化及意义[J].中华急诊医学杂志，2003，12，（7）：486-487.
[9]Alves NL，Arosa FA，van Lier RA. IL-21 sustains CD28 expressionon IL-15-activated human naive CD8+ T cells [J]. Immunol，2005，175（2）：755-762.
[10]Belkaid Y，Rouse BT. Natural regulatory T cells in infrctious disease [J]. Immunol，2005，6：353-360.
[11]姚永明.多脏器功能障碍综合征发病机制研究新进展[J].中华急诊医学杂志，2001，10（1）：63-64.
[12]Godlove J，Chiu WK，Weng NP. Gene expression and generation of CD28-CD8 T cells mediated by interleukin 15 [J]. Exp Gerontol，2007，42(5)：412-415.
[13]高越，何建如，陈小青.急性有机磷农药中毒并发多器官功能障碍综合征患者T淋巴细胞亚群的研究[J].中华工业医学杂志，2003，16，（2）：463-465.
[14]金欣，陈建魁，于农，等.血清半胱氨酸蛋白酶抑制剂C评估有机磷中毒患者肾功能损害的临床价值[J].临床误诊误治，2012，25（2）：29-31.
[15]马健，刘慧丽，杨志明，等.急性有机磷农药中毒患者氯解磷定用量的研究[J].中国医药导报，2013，10（4）：160-162.
[16]李激文.血液灌流救治45例有机磷农药中毒合并阿托品中毒的疗效分析[J].中国医药导报，2010，7（12）：94-95.
（收稿日期：2014-02-27本文编辑：任念）
